רקומבינציה הומולוגית (HR) היא מנגנון בעל נאמנות גבוהה של תיקון שברים דו-גדיליים בדנ”א (DSBs), קישורים צולבים בין גדילים ופערי ssDNA, כמו גם מסלול לעמידות בפני נזקי DNA. HR שונה ממסלולים מועדים לשגיאות לתיקון/סובלנות נזקי DNA, כגון צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) וסינתזת טרנסלציה, בכך שהוא משתמש בדנ”א דופלקס שלם והומולוגי כתורם לעיצוב אירוע התיקון. יתר על כן, רבים מהמתווכים המרכזיים במסלול משאבי אנוש הם הפיכים, ומאפשרים ויסות מעולה של שלבי המסלול הבודדים. במהלך שלבי S, G2 ו-M של מחזור התא, HR מתחרה עם NHEJ על תיקון ה-DSBs¹ הדו-קצוות. בנוסף, HR חיוני לשכפול דנ”א לתיקון נזקי דנ”א הקשורים לשכפול, כולל פערי ssDNA ו- DSBs חד-צדדיים, וכמנגנון של מעקף נגע DNA².

אמצעי ביניים קריטי במסלול משאבי אנוש הוא לולאת התזוזה, או לולאת D (איור 1). לאחר כריתת הסוף, הרקומבינאז המרכזי בתגובה, Rad51, נטען על ה-ssDNA החדש של המולקולה השבורה, ויוצר נימה סלילית². לאחר מכן Rad51 מבצע חיפוש הומולוגי כדי לזהות תורם הומולוגי מתאים, בדרך כלל כרומטיד האחות בתאים סומטיים. לולאת D נוצרת כאשר נימה Rad51-ssDNA פולשת לדנ”א דופלקס הומולוגי, מה שמוביל לזיווג בסיס ווטסון-קריק של הגדיל השבור עם הגדיל המשלים של התורם, תוך הזזת גדיל התורם הנגדי. הרחבה של קצה ה-3′ של הגדיל השבור על ידי פולימראז דנ”א מחליפה את הבסיסים שאבדו במהלך אירוע הנזק לדנ”א ומקדמת את הרזולוציה של ביניים לולאת D המורחבת למכפלת dsDNA באמצעות חישול גדיל תלוי סינתזה (SDSA), צומת הולידיי כפול (dHJ), או תת-מסלולי HR של שכפול המושרה על ידי שבירה (BIR).

בדיקות המנטרות פיזית את המתווכים במסלול משאבי אנוש מאפשרות ניתוח של הדרישות הגנטיות לכל שלב (כלומר, ניתוח מסלול). היווצרות DSB, כריתת קצה, dHJs, בועות שכפול BIR ומוצרי HR נצפים בקלות על ידי כתם דרומי ^3,4,5,6,7. עם זאת, כתם דרומי אינו מדווח על לולאות D מתהוות ומורחבות, ולכן נדרשת^שיטה חלופית למדידה אמינה של מולקולות מפרקים אלה ^4,8,9. אסטרטגיה נפוצה אחת לניתוח היווצרות לולאת D מתהווה היא כרומטין-מיצוי חיסוני (ChIP) של Rad51 בשילוב עם PCR כמותי (qPCR)^10,11. עם זאת, הקשר של Rad51 עם dsDNA כפי שנמדד על ידי ChIP-qPCR אינו תלוי בהומולוגיה של רצף ובגורם האביזרים Rad51 Rad54^10,11. לעומת זאת, אות ניכר המשתמש בשיטה של ניתוח לולאת D המוצגת כאן, הנקראת בדיקת לכידת לולאת D (DLC), תלוי בהיווצרות DSB, הומולוגיה של רצף, Rad51, וחלבוני העזר Rad51 Rad52 ו- Rad54⁸. הממצא כי Saccharomyces cerevisiae Rad51-מקודם D-loop היווצרות תלויה ב- Rad54 in vivo עולה בקנה אחד עם ניסויים רבים בשחזור חוץ גופי המצביעים על כך ש- Rad54 נדרש לחיפוש הומולוגי ויצירת לולאת D על ידי ניצני שמרים Rad51 8,12,13,14,15.

הגישות הנוכחיות למדידת הארכת לולאת D, בעיקר באמצעות PCR כמותי למחצה, הן בעייתיות באופן דומה. בדיקה טיפוסית מבוססת PCR לאיתור הארכת D-loop מגבירה רצף ייחודי, הנובע מרקומבינציה בין אתר הפסקה לתורם חוץ רחמי ומסינתזת הדנ”א הקשורה לרקומבינציה שלאחר מכן, באמצעות פריימר במעלה הזרם של אזור ההומולוגיה על הגדיל השבור ופריימר נוסף במורד הזרם של אזור ההומולוגיה על גדיל התורם. באמצעות שיטה זו, זיהוי של סינתזת DNA הקשורה לרקומבינציה דורש את גורם העיבוד הלא חיוני של Pol δ Pol32¹⁶. ממצא זה סותר את התצפית כי למחיקה של POL32 יש השפעה קלה בלבד על המרת גנים in vivo¹⁷. יתר על כן, בדיקות מבוססות PCR אלה אינן מצליחות לפתור באופן זמני את הרחבת לולאת D ואת היווצרות המוצר של BIR, מה שמרמז על כך שהאות נובע ממוצרי dsDNA ולא מתווך ssDNA^17,18,19. בדיקת הרחבת D-loop (DLE) פותחה לאחרונה כדי לטפל בפערים אלה. בדיקת ה-DLE מכמתת סינתזת דנ”א הקשורה לרקומבינציה באתר של ~400 זוגות בסיסים (bp) במורד הזרם של הקצה הפולש הראשוני 3′⁹. בשיטה זו, הרחבת D-loop אינה תלויה ב-Pol32 וניתנת לזיהוי תוך 4 שעות לאחר אינדוקציה של DSB, בעוד שתוצרי BIR נצפים לראשונה ב-6 שעות. ואכן, פרסום שפורסם לאחרונה במעבדות הבר ומלקובה ציין כי שימוש בשיטה זו של הכנת דנ”א גנומי מביא לשימור ssDNA ^9,20.

כאן, מבחני DLC ו- DLE מתוארים בפירוט. מבחנים אלה מסתמכים על קשירת קרבה כדי לזהות לולאות D מתהוות ומורחבות ב-S. cerevisiae (איור 2)^8,9. ניתן לכמת מוצרי BIR באמצעות אותה מערכת בדיקה. עבור שני המבחנים, היווצרות DSB באתר חיתוך אנדונוקלאז HO הממוקם בלוקוס URA3 על כרומוזום (Chr.) V מושרית על ידי הביטוי של אנדונוקלאז HO תחת שליטתו של מקדם גלקטוז הניתן להשרה. פלישת גדילי דנ”א בתיווך Rad51 מובילה להיווצרות לולאת D מתהווה באתר של תורם חוץ רחמי הממוקם במוקד LYS2 ב- Chr. II. מכיוון שהצד הימני של ה- DSB חסר הומולוגיה לתורם, תיקון באמצעות SDSA ו- dHJ אינו אפשרי. תיקון ראשוני של DSB על ידי BIR אפשרי, אבל היווצרות של מוצרים קיימא מעוכב על ידי נוכחות של centromere²¹. תכנון מכוון זה מונע תיקון DSB פרודוקטיבי, ובכך מונע את חידוש הצמיחה על ידי תאים עם DBSs מתוקנים, אשר אחרת יכול לעקוף את התרבית במהלך ניתוח מהלך הזמן.

במבחן DLC, קישור צולב פסורלן של שני הגדילים של הדנ”א ההטרודופלקס בתוך לולאת D משמר את ביניים הרקומבינציה. לאחר שיקום אתר אנזים ההגבלה על הגדיל השבור (שנכרת) והעיכול, הקישור הצולב מאפשר קשירת הרצפים הייחודיים במעלה הזרם של הדנ”א ההומולוגי השבור והתורם. באמצעות qPCR, ניתן לכמת את רמת מולקולת הדנ”א הכימרית הקיימת בכל דגימה. במבחן DLE, אין צורך בקישור צולב, ושיקום ועיכול אתר אנזים ההגבלה ואחריו קשירה תוך-מולקולרית מקשרים במקום זאת את קצה 5′ של המולקולה השבורה לקצה החדש של 3′. שוב, qPCR משמש לכימות הכמויות היחסיות של מוצר כימרי זה בכל דגימה. בהיעדר שחזור אתר אנזים הגבלה, בדיקת ה-DLE מדווחת על הרמות היחסיות של תוצר ה-BIR (dsDNA) שנוצר בעקבות הארכת לולאת D.

מוצגות תוצאות מייצגות עבור כל בדיקה המשתמשת בזן מסוג פראי, והקוראים מופנים לפיאצה et al.8 ולפיאצה ואחרים לשימוש במבחנים אלה לניתוח מוטציות רקומבינציה ^8,9. מטרת תרומה זו היא לאפשר למעבדות אחרות לאמץ את מבחני DLC ו- DLE, ותמיכה בהם זמינה על פי בקשה.