Isolatie en directe neuronale herprogrammering van muisastryoten

Het centrale zenuwstelsel van zoogdieren (CZS) is zeer complex en bestaat uit honderden verschillende celtypen, waaronder een groot aantal verschillende neuronale subtypen 1,2,3,4,5,6. In tegenstelling tot andere organen of weefsels ^7,8,9 heeft het CZS van zoogdieren een zeer beperkt regeneratief vermogen; neuronaal verlies na traumatisch hersenletsel of neurodegeneratie is onomkeerbaar en resulteert vaak in motorische en cognitieve tekorten¹⁰. Gericht op het redden van hersenfuncties, worden verschillende strategieën om verloren neuronen te vervangen intensief onderzocht¹¹. Onder hen is directe herprogrammering van somatische cellen in functionele neuronen in opkomst als een veelbelovende therapeutische aanpak¹². Directe herprogrammering, of transdifferentiatie, is het proces van het omzetten van een gedifferentieerd celtype in een nieuwe identiteit zonder door een intermediaire proliferatieve of pluripotente toestand te gaan 13,14,15,16. Gepionierd door de identificatie van MyoD1 als een factor die voldoende is om fibroblasten om te zetten in spiercellen ^17,18, is deze methode met succes toegepast om verschillende celtypen te herprogrammeren in functionele neuronen 19,20,21.

Astrocyten, de meest voorkomende macroglia in het CZS ^22,23, zijn om verschillende redenen een bijzonder veelbelovend celtype voor directe neuronale herprogrammering. Ten eerste zijn ze wijd en gelijkmatig verdeeld over het CZS, wat een overvloedige locobron voor nieuwe neuronen oplevert. Ten tweede zijn astrocyten en neuronen ontwikkelingsmatig nauw verwant, omdat ze een gemeenschappelijke voorouder delen tijdens de embryonale ontwikkeling, de radiale gliacellen²⁴. De gemeenschappelijke embryonale oorsprong van de twee celtypen lijkt neuronale conversie te vergemakkelijken in vergelijking met herprogrammering van cellen uit verschillende kiemlagen^19,21. Bovendien wordt patrooninformatie die door astrocyten wordt geërfd door hun radiale glia-oorsprong ook gehandhaafd in volwassen astrocyten 25,26,27, en lijkt het bij te dragen aan het genereren van regionaal geschikte neuronale subtypen 28,29,30. Daarom is het onderzoeken en begrijpen van de omzetting van astrocyten in neuronen een belangrijk onderdeel van het bereiken van het volledige potentieel van deze techniek voor op cellen gebaseerde vervangingsstrategieën.

De omzetting van in vitro gekweekte astrocyten in neuronen heeft geleid tot verschillende doorbraken op het gebied van directe neuronale herprogrammering, waaronder: i) de identificatie van transcriptiefactoren die voldoende zijn om neuronen uit astrocyten te genereren 15,19,31, ii) het ontrafelen van moleculaire mechanismen veroorzaakt door verschillende herprogrammeringsfactoren in dezelfde cellulaire context ³² , en iii) het benadrukken van de impact van de ontwikkelingsoorsprong van de astrocyten op het induceren van verschillende neuronale subtypen 28,29,33. Bovendien ontrafelde in vitro directe conversie van astrocyten verschillende belangrijke hindernissen die directe neuronale herprogrammering^{beperken 34,35}, zoals verhoogde reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie³⁴ en verschillen tussen het mitochondriale proteoom van astrocyten en neuronen³⁵. Vandaar dat deze waarnemingen sterk het gebruik van primaire culturen van astrocyten ondersteunen als een model voor directe neuronale herprogrammering om verschillende fundamentele vragen in de biologie te onderzoeken¹², gerelateerd aan het onderhoud van de celidentiteit, wegversperringen die veranderingen in het lot van cellen voorkomen, evenals de rol van het metabolisme bij herprogrammering.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om astrocyten te isoleren van muizen op postnatale (P) leeftijd met een zeer hoge zuiverheid, zoals aangetoond door het isoleren van astrocyten uit het muizenmerg²⁹. We bieden ook protocollen om astrocyten te herprogrammeren in neuronen via virale transductie of DNA-plasmidetransfectie. Geherprogrammeerde cellen kunnen worden geanalyseerd op 7 dagen na transductie (7 DPT) om verschillende aspecten te beoordelen, zoals herprogrammeringsefficiëntie en neuronale morfologie, of kunnen gedurende enkele weken in cultuur worden gehouden om hun rijping in de loop van de tijd te beoordelen. Belangrijk is dat dit protocol niet specifiek is voor ruggenmergastrocyten en gemakkelijk kan worden toegepast om astrocyten te isoleren uit verschillende andere hersengebieden, waaronder de corticale grijze stof, middenhersenen en cerebellum.