마우스 성상세포의 분리 및 직접 뉴런 리프로그래밍

포유동물 중추신경계(CNS)는 매우 복잡하며, 방대한 수의 상이한 뉴런 아형 1,2,3,4,5,6을 포함하는 수백 개의 상이한 세포 유형들로 구성된다. 다른 기관 또는 조직 ^7,8,9와는 달리^, 포유동물 CNS는 매우 제한된 재생 능력을 갖는다; 외상성 뇌 손상 또는 신경 변성에 따른 신경 세포 손실은 돌이킬 수 없으며 종종 운동 및인지 결핍을 초래합니다¹⁰. 뇌 기능을 구하기 위해 잃어버린 뉴런을 대체하기위한 다양한 전략이 집중적 인 조사를 받고 있습니다¹¹. 그 중에서도, 체세포를 기능적 뉴런으로 직접 재프로그래밍하는 것은 유망한 치료 접근법¹²로 부상하고 있다. 직접 재프로그래밍 또는 전분화는 하나의 분화된 세포 유형을 중간 증식성 또는 다능성 상태^13,14,15,16을 거치지 않고 새로운 동일성으로 전환시키는 과정이다. 섬유아세포를 근육세포(^17,18)로 전환시키기에 충분한 인자로서 MyoD1의 확인에 의해 개척된 이 방법은 여러 세포 유형을 기능적 뉴런^(19,20,21)으로 재프로그래밍하는데 성공적으로 적용되었다.

CNS^22,23에서 가장 풍부한 거대 아교세포 인 성상 세포는 여러 가지 이유로 직접 신경 재 프로그래밍을위한 특히 유망한 세포 유형입니다. 첫째, 그들은 CNS에 걸쳐 광범위하고 균등하게 분포되어 새로운 뉴런을위한 유전자좌 공급원이 풍부합니다. 둘째, 성상세포와 뉴런은 배아 발달 동안 공통조상인 방사상 신경교세포(²⁴)를 공유하기 때문에 발달적으로 밀접한 관련이 있다. 두 세포 유형의 일반적인 배아 기원은 상이한 배아층^19,21로부터의 세포의 재프로그래밍과 비교하여 뉴런 전환을 촉진하는 것으로 보인다. 더욱이, 그들의 방사상 신경교세포 기원을 통해 성상세포에 의해 유전된 패터닝 정보는 성인 성상세포(^25,26,27)에서도 유지되며, 지역적으로 적절한 뉴런 아형(^28,29,30)의 생성에 기여하는 것으로 보인다. 따라서 성상세포가 뉴런으로 전환되는 것을 조사하고 이해하는 것은 세포 기반 대체 전략에 대한이 기술의 잠재력을 최대한 발휘하는 데 중요한 부분입니다.

시험관내 배양된 성상세포를 뉴런으로 전환시키는 것은 다음을 포함하는 직접적인 뉴런 리프로그래밍 분야에서 몇 가지 돌파구를 가져왔다: i) 성상세포로부터 뉴런을 생성하기에 충분한 전사 인자의 확인^15,19,31, ii) 동일한 세포 맥락에서 상이한 리프로그래밍 인자에 의해 촉발된 분자 메커니즘의 풀림⁽³²) iii) 성상세포의 발달 기원이 상이한 뉴런 아류형을 유도하는 것에 미치는 영향을 강조한다^28,29,33. 더욱이, 성상세포의 시험관내 직접 전환은 증가된 반응성 산소 종(ROS) 생산(34) 및 성상세포와 뉴런(³⁵)의 미토콘드리아 프로테옴 사이의 차이와 같은 직접적인 뉴런 재프로그래밍(^34,35)을 제한하는 몇 가지 주요 장애물을 풀었다. 따라서 이러한 관찰은 세포 정체성 유지, 세포 운명 변화를 막는 장애물 및 재 프로그래밍에서 신진 대사의 역할과 관련된 생물학¹²의 몇 가지 근본적인 질문을 조사하기 위해 직접 신경 재 프로그래밍을위한 모델로서 성상 세포의 일차 배양을 사용하는 것을 강력히지지합니다.

여기서 우리는 뮤린 척수²⁹로부터 성상세포를 분리함으로써 입증된 바와 같이, 매우 높은 순도로 출생 후 (P) 나이에 마우스로부터 성상세포를 분리하기 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한 바이러스 형질도입 또는 DNA 플라스미드 형질감염을 통해 성상세포를 뉴런으로 재프로그래밍하는 프로토콜을 제공한다. 재프로그램된 세포는 형질도입 후 7일(7 DPT)에서 분석되어 리프로그래밍 효율 및 뉴런 형태학과 같은 다양한 측면을 평가하거나, 수주 동안 배양물에서 유지될 수 있고, 시간에 따른 성숙을 평가할 수 있다. 중요하게도, 이 프로토콜은 척수 성상세포에 특이적이지 않으며, 피질 회색 물질, 중뇌 및 소뇌를 포함한 다양한 다른 뇌 영역으로부터 성상세포를 분리하는데 용이하게 적용될 수 있다.