マウスアストロサイトの単離と直接ニューロンリプログラミング

哺乳類の中枢神経系(CNS)は非常に複雑であり、膨大な数の異なるニューロンサブタイプ¹、²、³、⁴、^5、6を含む何百もの異なる細胞型からなる。他の器官または組織⁷、⁸、⁹とは異なり^、哺乳動物CNSは非常に限られた再生能力を有する。外傷性脳損傷または神経変性に続くニューロン喪失は不可逆的であり、しばしば運動的および認知的欠損をもたらす¹⁰。脳機能を救うことを目指して、失われたニューロンを置き換えるためのさまざまな戦略が、激しい調査を受けている¹¹。その中で、体細胞を機能的ニューロンに直接リプログラミングすることは、有望な治療的アプローチとして浮上している¹²。直接リプログラミング、または分化転換は、中間増殖性または多能性状態を経ることなく、1つの分化した細胞型を新しい同一性に変換するプロセスである¹³、14^、15、16。線維芽細胞を筋細胞に変換するのに十分な因子としてのMyoD1の同定によって先駆的に^{開発された17,18}、この方法は、いくつかの細胞型を機能的ニューロンに再プログラムするために首尾よく適用されてきた¹⁹、^20、21。

アストロサイトは、CNS²²、²³において最も豊富なマクログリアであり、いくつかの理由から^、直接ニューロンリプログラミングのために特に有望な細胞型である。第一に、それらはCNS全体に広く均等に分布しており、新しいニューロンのための豊富なロコ源を提供する。第2に、アストロサイトとニューロンは、胚発生中に共通の祖先、放射状グリア細胞²⁴を共有するように、発達的に密接に関連している。2つの細胞型の共通の胚起源は、異なる胚葉からの細胞のリプログラミングと比較してニューロン変換を促進するようである^19、21。さらに、その放射状グリア起源を介してアストロサイトによって受け継がれるパターニング情報は、成体アストロサイト²⁵、²⁶、²⁷においても維持され、かつ、局所的に適切なニューロンサブタイプ^28、29、30の生成に寄与するようである。したがって、アストロサイトのニューロンへの変換を調査および理解することは、細胞ベースの置換戦略のためのこの技術の可能性を最大限に引き出すための重要な部分です。

インビトロ培養アストロサイトのニューロンへの変換は、直接ニューロンリプログラミングの分野において、i)アストロサイトからニューロンを生成するのに十分な転写因子の同定15、^19、31、ii)同じ細胞コンテキストにおける異なるリプログラミング因子によって引き起こされる分子機構の解明を含むいくつかのブレークスルーをもたらした³²iii)異なるニューロンサブタイプの誘導に対するアストロサイトの発達起源の影響を強調する²⁸、^29、33。さらに、アストロサイトのインビトロ直接変換は、活性酸素種(ROS)産生の増加34およびアストロサイトとニューロン35のミトコンドリアプロテオームの違いなど、直接ニューロンリプログラミング^34、35を制限するいくつかの主要なハードルを解明した。したがって、これらの観察は、細胞同一性の維持、細胞の運命の変化を防ぐ障害、およびリプログラミングにおける代謝の役割に関連する生物学¹²におけるいくつかの基本的な問題を調査するための直接ニューロンリプログラミングのモデルとしてのアストロサイトの初代培養の使用を強く支持する。

ここでは、マウス脊髄²⁹からアストロサイトを単離することによって実証されるように、出生後(P)年齢のマウスから非常に高い純度でアストロサイトを単離するための詳細なプロトコルを提示する。また、ウイルス形質導入またはDNAプラスミドトランスフェクション を介して アストロサイトをニューロンに再プログラムするためのプロトコルも提供しています。リプログラミングされた細胞は、形質導入後7日間(7DPT)で分析して、リプログラミング効率やニューロン形態などのさまざまな側面を評価するか、または数週間培養中に維持して経時的な成熟を評価することができます。重要なことに、このプロトコルは脊髄アストロサイトに特異的ではなく、皮質灰白質、中脳、小脳を含む様々な他の脳領域からアストロサイトを単離するために容易に適用することができる。