O sistema nervoso central dos mamíferos (SNC) é altamente complexo, consistindo de centenas de tipos de células diferentes, incluindo um grande número de diferentes subtipos neuronais 1,2,3,4,5,6. Ao contrário de outros órgãos ou tecidos ^7,8,9, o CNS mamífero tem uma capacidade regenerativa muito limitada; a perda neuronal após lesão cerebral traumática ou neurodegeneração é irreversível e muitas vezes resulta em déficits motores e cognitivos¹⁰. Com o objetivo de resgatar funções cerebrais, diferentes estratégias para substituir neurônios perdidos estão sob intensa investigação¹¹. Entre eles, a reprogramação direta de células somáticas em neurônios funcionais está emergindo como uma abordagem terapêutica promissora¹². Reprogramação direta, ou transdiferenciação, é o processo de conversão de um tipo de célula diferenciada em uma nova identidade sem passar por um estado de proliferação intermediária ou pluripotente 13,14,15,16. Pioneiro pela identificação do MyoD1 como fator suficiente para converter fibroblastos em células musculares^17,18, este método foi aplicado com sucesso para reprogramar vários tipos celulares em neurônios funcionais 19,20,21.

Os astrócitos, a macroglia mais abundante no CNS^22,23, são um tipo celular particularmente promissor para reprogramação neuronal direta por várias razões. Em primeiro lugar, eles são amplamente e uniformemente distribuídos através do CNS, fornecendo uma abundante fonte in loco para novos neurônios. Em segundo lugar, os astrócitos e os neurônios estão intimamente relacionados, pois compartilham um ancestral comum durante o desenvolvimento embrionário, as células gliais^{radiais 24}. A origem embrionária comum dos dois tipos de células parece facilitar a conversão neuronal em comparação com a reprogramação de células de diferentes camadas germinativas^19,21. Além disso, a padronização das informações herdadas pelos astrócitos através de sua origem radial glia também é mantida em astrócitos adultos ^25,26,27, e parece contribuir para a geração de subtipos neuronais regionalmente apropriados 28,29,30. Assim, investigar e entender a conversão de astrócitos em neurônios é uma parte importante para alcançar todo o potencial dessa técnica para estratégias de substituição baseadas em células.

A conversão de astrócitos in vitro cultivados em neurônios levou a vários avanços no campo da reprogramação neuronal direta, incluindo: i) a identificação de fatores de transcrição suficientes para gerar neurônios a partir de astrócitos 15,19,31, ii) o desenrolar de mecanismos moleculares desencadeados por diferentes fatores de reprogramação no mesmo contexto celular ³² , e iii) destacando o impacto da origem do desenvolvimento dos astrócitos na indução de diferentes subtipos neuronais 28,29,33. Além disso, a conversão direta in vitro de astrócitos desvendou vários obstáculos importantes que limitam a reprogramação neuronal direta^34,35, como o aumento da produção de oxigênio reativo (ROS)³⁴ e diferenças entre o proteome mitocondrial de astrócitos e neurônios³⁵. Assim, essas observações apoiam fortemente o uso de culturas primárias de astrócitos como modelo de reprogramação neuronal direta para investigar várias questões fundamentais na biologia¹², relacionadas à manutenção da identidade celular, bloqueios nas estradas que impedem mudanças no destino celular, bem como o papel do metabolismo na reprogramação.

Aqui apresentamos um protocolo detalhado para isolar os astrócitos de camundongos na idade pós-natal (P) com pureza muito alta, como demonstrado pela isolação de astrócitos da medula espinhal murina²⁹. Também fornecemos protocolos para reprogramar astrócitos em neurônios via transdução viral ou transfecção plasmida de DNA. As células reprogramadas podem ser analisadas em 7 dias após a transdução (7 DPT) para avaliar vários aspectos, como eficiência de reprogramação e morfologia neuronal, ou podem ser mantidas na cultura por várias semanas, para avaliar seu amadurecimento ao longo do tempo. É importante ressaltar que este protocolo não é específico para astrócitos da medula espinhal e pode ser facilmente aplicado para isolar astrócitos de várias outras regiões cerebrais, incluindo a matéria cinzenta cortical, o cérebro médio e o cerebelo.