Summary

На месте Гибридизация у личинок и молоди рыбок данио во время развития мезонефроса

Published: August 13, 2021
doi:

Summary

Рыбка данио является важной моделью для понимания развития почек. Здесь протокол гибридизации in situ оптимизирован для обнаружения экспрессии генов у личинок рыбок данио и молоди во время развития мезонефроса.

Abstract

Рыбка данио образует две почечные структуры за свою жизнь. Пронефрос (эмбриональная почка) образуется во время эмбрионального развития и начинает функционировать через 2 дня после оплодотворения. Состоящий только из двух нефронов, пронефрос служит единственной почкой во время личиночной жизни, пока не потребуется больше функции почек из-за увеличения массы тела. Чтобы справиться с этой более высокой потребностью, мезонефрос (взрослая почка) начинает формироваться во время метаморфоза. Новые первичные нефроны сливаются с пронефрами и образуют соединенные просветы. Затем вторичные нефроны сливаются с первичными (и так далее), чтобы создать разветвленную сеть в мезонефросе. Подавляющее большинство исследований сосредоточено на пронефросах из-за простоты использования эмбрионов. Таким образом, необходимо разработать методы изучения более старых и крупных личинок и молоди рыб, чтобы лучше понять развитие мезонефроса. Здесь протокол гибридизации in situ для анализа экспрессии генов оптимизирован для проникновения зонда, промывки зондов и антител, а также отбеливания пигментов для лучшей визуализации мезонефроса. Трансгенная линия Tg(lhx1a-EGFP) используется для маркировки клеток-предшественников и дистальных канальцев зарождающихся нефронов. Этот протокол заполняет пробел в исследованиях мезонефроса. Это важная модель для понимания того, как новые ткани почек формируются и интегрируются с существующими нефронами и дают представление о регенеративной терапии.

Introduction

Эмбрион рыбки данио является важной моделью для изучения развития тканей из-за его небольшого размера, прозрачности, доступных инструментов и выживаемости без кормления в течение пяти дней1,2. Это в значительной степени способствовало пониманию развития почек и сохранения между рыбками данио и млекопитающими3,4,5. Почки играют важную роль в поддержании гомеостаза жидкости, фильтрации крови и выведении отходов6. Нефрон, функциональная единица почки, содержит фильтр крови, соединенный с длинным канальцем. У рыбок данио две почечные структуры формируются на протяжении всей ее жизни. Пронефрос (временная эмбриональная почка) образуется сначала во время раннего развития. Он состоит из двух нефронов, проходящих вдоль передне-задней оси и становится функциональным примерно через 2 дня после оплодотворения (dpf). Полезность пронефроса заключается в его простоте, имея всего два нефрона, которые в основном линейны и легко визуализируются (хотя проксимальный извитый каналец начинает сворачиваться при трех dpf)3. Это облегчило не только изучение его раннего развития из промежуточной мезодермы, но и структуру сегментации и ремонт канальцев7,8.

Полезность рыбок данио становится ограниченной после пяти dpf, когда желток уменьшается и личинки полагаются на питание в водной системе9. Примерно в возрасте 2 недель личинки претерпевают метаморфозы в молодых особей, где образуются новые ткани, а старые ткани теряются и/или реорганизуются9. Это также когда образуется мезонефрос (постоянная взрослая почка) 10,11,12. Первый взрослый нефрон образуется около шестого сомита и сливается с дистальным ранним канальцем пронефроса. Дополнительные нефроны добавляются сзади к этому положению изначально, но также и к передней части позже. Первичные нефроны в этой первой волне сливаются с канальцами пронефроса и имеют общий просвет для осаждения своих отходов. Вторичные нефроны образуются в следующей волне и сливаются с первичными нефронами. Этот повторяющийся процесс создает мезонефрос, который разветвлен, несколько сродни почке млекопитающих. Предположительно, пронефрос в конечном итоге теряет свою трубчатую идентичность и становится двумя основными собирательными протоками, где все нефроны сливают свои отходы13.

До образования первого взрослого нефрона одиночные клетки-предшественники начинают появляться в ~4 мм (общая длина) личинок (~10 dpf). Эти клетки, которые отмечены в трансгенной линии Tg(lhx1a-EGFP), прилипают к пронефросу и, по-видимому, мигрируют в будущие места нефрогенеза. Отдельные клетки объединяются в кластеры, которые дифференцируются в новые нефроны12. Неясно, где находятся эти клетки или какие гены они экспрессируют до начала мезонефрогенеза.

Понимание развития мезонефроса дает представление о почках млекопитающих так, как пронефрос не может. К ним относятся образование нефрогенных агрегатов из одиночных клеток-предшественников, функциональная интеграция новых нефронов с существующими и ветвящийся морфогенез. Тем не менее, существуют ограничения для изучения постэмбрионального развития. Личинки менее прозрачны из-за их большего размера и пигментации. Временная шкала развития не является синхронной среди отдельных животных и сильно зависит от факторов окружающей среды, таких как кормление и скученность9,14. Хотя нокдаун-реагенты существуют, они менее эффективны в личинках по сравнению с эмбрионами15. В этом протоколе описан метод гибридизации in situ для определения экспрессии генов во время развития мезонефроса рыбок данио. Несколько шагов оптимизированы для увеличения визуализации мезонефроса и проникновения и промывки зонда и антитела. Трансгенная линия Tg(lhx1a-EGFP) используется вместе с зондом для EGFP для маркировки одиночных клеток-предшественников, нефрогенных агрегатов и дистальных канальцев зарождающихся нефронов. Этот метод обеспечит более глубокое понимание развития мезонефроса и понимание регенеративной терапии.

Protocol

Использование личинок рыбок данио и молоди одобрено IUP IACUC (протокол No02-1920, No08-1920). Сведения о содержимом решения приведены в Таблице материалов. 1. Разведение личинок ПРИМЕЧАНИЕ: Для поднятия личинок и молоди до стадии интереса потребуется до 21 дня и …

Representative Results

Используя трансгенную линию Tg(lhx1a-EGFP), было продемонстрировано, что этот протокол гибридизации in situ эффективен при маркировке клеток-предшественников почек и различных нефроновых структур во время развития мезонефроса. Как и ожидалось, центральная нервная система также поме?…

Discussion

Описанный здесь метод гибридизации in situ направлен на изучение развития мезонефроса. Однако его можно применять для изучения развития других тканей и органов во время метаморфоз, таких как кишечник, нервная система, чешуя и пигментация14. Зонды могут быть сгенерированы…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Финансирование было предоставлено Академией наук Пенсильвании и Содружеством биологов Пенсильвании, а также Университетом Индианы в Пенсильвании (Школа аспирантуры и исследований, Департамент биологии и Фонд биологии синтии Сушак для передового опыта). Трансгенная линия Tg(lhx1a-EGFP) была предоставлена доктором Нилом Хукриде (Университет Питтсбурга).

Materials

Anti-fluorescein antibody Roche/Sigma-Aldrich 11426338910
Bleaching solution 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST
Blocking reagent Roche/Sigma-Aldrich 11096176001 Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction
Cell strainer Fisher Scientific  22-363-549 100 μm
E3 medium 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue
Eyelash manipulator Fisher Scientific NC1083208 Use to manipulate larvae
Fixing solution 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down
Fluorescein probe synthesis Roche/Sigma-Aldrich 11685619910
Glass vial Fisher Scientific 03-338B
Hatchfry encapsulation Argent
Hyb- solution 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20
Hyb+ solution HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin
MAB (10X) 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5
MABT 1X MAB, 0.1% Tween-20
Maleic acid Sigma-Aldrich M0375
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
PBS (10X) 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4
PBST 1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST2 1X PBS, 0.2% Tween-20
Powder food Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well
Proteinase K Sigma-Aldrich P5568 Use to permeabilize larvae
Proteinase K solution 20  μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST
Spirulina microfine powder Argent
SSC (20X) 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave
SSCT (0.2X) Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
SSCT (2X) Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
Staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20
Staining solution 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer
Stopping solution 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST
Torula (yeast) RNA Sigma-Aldrich R6625
Tricaine Sigma Aldrich E10521 2%, pH 7
Wash buffer 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20

Referências

  1. Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
  2. Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish – emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
  3. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  4. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
  5. Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
  6. Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
  7. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
  8. Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
  9. McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
  10. Diep, C. Q., et al. Development of the zebrafish mesonephros. Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).
  11. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
  12. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
  13. Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. . The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).
  14. Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  15. Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
  16. Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
  17. Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Biologia do Desenvolvimento. 256 (2), 221-241 (2003).
  18. Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
  19. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).

Play Video

Citar este artigo
Kasar, S. N., Grandinette, S. A., Semelsberger, S. D., Diep, C. Q. In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development. J. Vis. Exp. (174), e62930, doi:10.3791/62930 (2021).

View Video