Sul posto Ibridazione in larve di zebrafish e giovani durante lo sviluppo di Mesonephros
Summary
Il pesce zebra è un modello importante per comprendere lo sviluppo del rene. Qui, un protocollo di ibridazione in situ è ottimizzato per rilevare l’espressione genica nelle larve di zebrafish e nei giovani durante lo sviluppo del mesonephros.
Abstract
Il pesce zebra forma due strutture renali nel corso della sua vita. Il pronephros (rene embrionale) si forma durante lo sviluppo embrionale e inizia a funzionare a 2 giorni dopo la fecondazione. Costituito da soli due nefroni, il pronephros funge da unico rene durante la vita larvale fino a quando non è richiesta una maggiore funzionalità renale a causa dell’aumento della massa corporea. Per far fronte a questa maggiore domanda, il mesonephros (rene adulto) inizia a formarsi durante la metamorfosi. I nuovi nefroni primari si fondono con il pronephros e formano lumen collegati. Quindi, i nefroni secondari si fondono con quelli primari (e così via) per creare una rete ramificata nel mesonefro. La stragrande maggioranza della ricerca si concentra sul pronephros a causa della facilità di utilizzo degli embrioni. Pertanto, è necessario sviluppare tecniche per studiare larve più vecchie e più grandi e pesci giovani per comprendere meglio lo sviluppo del mesonephros. Qui, un protocollo di ibridazione in situ per l’analisi dell’espressione genica è ottimizzato per la penetrazione della sonda, il lavaggio di sonde e anticorpi e lo sbiancamento dei pigmenti per visualizzare meglio il mesonefro. La linea transgenica Tg(lhx1a-EGFP) viene utilizzata per etichettare le cellule progenitrici e i tubuli distali dei nefroni nascenti. Questo protocollo colma una lacuna nella ricerca sul mesonefro. È un modello cruciale per capire come i nuovi tessuti renali si formano e si integrano con i nefroni esistenti e fornire approfondimenti sulle terapie rigenerative.
Introduction
L’embrione di zebrafish è un modello importante per lo studio dello sviluppo dei tessuti grazie alle sue piccole dimensioni, alla trasparenza, agli strumenti disponibili e alla sopravvivenza senza nutrirsi fino a cinque giorni1,2. Ha notevolmente contribuito alla comprensione dello sviluppo renale e alla conservazione tra zebrafish e mammiferi3,4,5. Il rene svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dell’omeostasi fluida, nel filtraggio del sangue e nell’escrezione dei rifiuti6. Il nefrone, l’unità funzionale del rene, comprende un filtro del sangue collegato a un lungo tubulo. Nel pesce zebra, due strutture renali si formano per tutta la sua vita. Il pronephros (il rene embrionale temporaneo) si forma prima durante lo sviluppo precoce. È costituito da due nefroni che corrono lungo l’asse anteriore-posteriore e diventa funzionale a circa 2 giorni dopo la fecondazione (dpf). L’utilità del pronephros sta nella sua semplicità, avendo solo due nefroni che sono per lo più lineari e facili da visualizzare (anche se il tubulo contorto prossimale inizia a ruotare a tre dpf)3. Ciò ha facilitato non solo gli studi sul suo sviluppo precoce dal mesoderma intermedio, ma anche il modello di segmentazione e la riparazione dei tubuli7,8.
L’utilità del pesce zebra diventa limitata dopo cinque dpf, quando il tuorlo è diminuito e le larve si affidano all’alimentazione nel sistema acquatico9. A circa 2 settimane di età, le larve subiscono metamorfosi in giovani, dove si formano nuovi tessuti e i vecchi tessuti vengono persi e/ o riorganizzati9. Questo è anche quando il mesonephros (il rene adulto permanente) forma10,11,12. Il primo nefrone adulto si forma vicino al sesto somite e si fonde con il tubulo distale precoce del pronephros. Ulteriori nefroni vengono aggiunti posteriormente a questa posizione inizialmente, ma anche verso l’anteriore in seguito. I nefroni primari in questa prima ondata si fondono con i tubuli del pronephros e condividono un lume comune per depositare i loro rifiuti. I nefroni secondari si formano nell’onda successiva e si fondono con i nefroni primari. Questo processo ripetitivo crea un mesonephros che è ramificato, in qualche modo simile al rene dei mammiferi. Presumibilmente, il pronephros alla fine perde la sua identità tubulare e diventa due importanti condotti di raccolta in cui tutti i nefroni drenano i loro rifiuti13.
Prima della formazione del primo nefrone adulto, le singole cellule progenitrici iniziano ad apparire in larve di ~ 4 mm (lunghezza totale) (~ 10 dpf). Queste cellule, che sono marcate nella linea transgenica Tg(lhx1a-EGFP ), aderiscono al pronephros e sembrano migrare verso futuri siti di nefrogenesi. Le singole cellule si fondono in cluster, che si differenziano in nuovi nefroni12. Non è chiaro dove risiedano queste cellule o quali geni esprimano prima dell’inizio della mesonefrogenesi.
Comprendere lo sviluppo del mesonefro fornisce informazioni sul rene dei mammiferi in modi che il pronephros non può. Questi includono la formazione di aggregati nefrogenici da singole cellule progenitrici, l’integrazione funzionale di nuovi nefroni con quelli esistenti e la morfogenesi ramificata. Tuttavia, ci sono limitazioni allo studio dello sviluppo postembrionale. Le larve sono meno trasparenti a causa delle loro dimensioni maggiori e della pigmentazione. La linea temporale dello sviluppo non è sincrona tra i singoli animali ed è fortemente dipendente da fattori ambientali, come l’alimentazione e l’affollamento9,14. Sebbene esistano reagenti knockdown, sono meno efficaci nelle larve rispetto agli embrioni15. In questo protocollo, viene descritto un metodo di ibridazione in situ per determinare l’espressione genica durante lo sviluppo del mesonephros zebrafish. Diversi passaggi sono ottimizzati per aumentare la visualizzazione del mesonefro e la penetrazione e il lavaggio della sonda e dell’anticorpo. La linea transgenica Tg (lhx1a-EGFP) viene utilizzata insieme a una sonda per EGFP per etichettare singole cellule progenitrici, aggregati nefrogenici e tubuli distali dei nefroni nascenti. Questo metodo fornirà una comprensione più profonda dello sviluppo del mesonefro e una visione approfondita delle terapie rigenerative.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di ibridazione in situ qui descritto ha lo scopo di studiare lo sviluppo del mesonefro. Tuttavia, può essere applicato per studiare lo sviluppo di altri tessuti e organi durante la metamorfosi, come l’intestino, il sistema nervoso, le squame e la pigmentazione14. Le sonde possono essere generate per geni endogeni o marcatori fluorescenti in linee transgeniche.
È fondamentale che le larve rimangano intatte per osservare gli organi e i tessuti nel lor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento è stato fornito dalla Pennsylvania Academy of Science, dal Commonwealth of Pennsylvania Biologists e dall’Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology e Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). La linea transgenica Tg (lhx1a-EGFP) è stata fornita dal Dr. Neil Hukriede (Università di Pittsburgh).
Materials
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
Referências
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