Summary

في سيتو التهجين في يرقات حمار وحشي والأحداث خلال تطوير Mesonephros

Published: August 13, 2021
doi:

Summary

الحمار الوحشي هو نموذج مهم لفهم نمو الكلى. هنا ، يتم تحسين بروتوكول التهجين في الموقع للكشف عن التعبير الجيني في يرقات حمار وحشي والأحداث أثناء تطور الميكسونفروس.

Abstract

تشكل سمكة الحمار الوحشي هيكلين للكلى في حياتها. تتشكل الفروس (الكلى الجنينية) أثناء النمو الجنيني وتبدأ في العمل بعد يومين من الإخصاب. تتكون من اثنين فقط من الكليفرونات ، يعمل الفروس ككلية وحيدة خلال حياة اليرقات حتى يلزم المزيد من وظائف الكلى بسبب زيادة كتلة الجسم. للتعامل مع هذا الطلب المرتفع ، يبدأ الموسونيفروس (الكلى البالغة) في التشكل أثناء التحول. الكلية الأولية الجديدة تنصهر إلى المعرضة وتشكل التجويفات المتصلة. ثم، تنصهر الكلية الثانوية إلى تلك الأولية (وهلم جرا) لإنشاء شبكة متفرعة في mesonephros. وتركز الغالبية العظمى من البحوث على المعرضة بسبب سهولة استخدام الأجنة. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تطوير تقنيات لدراسة اليرقات القديمة والأكبر والأسماك الأحداث لفهم أفضل لتطور الميكسونيفروس. هنا ، يتم تحسين بروتوكول التهجين في الموقع لتحليل التعبير الجيني لاختراق المسبار ، وغسل المسابير والأجسام المضادة ، وتبييض الأصباغ لتصور أفضل للمسونيفروس. يستخدم خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا لتسمية خلايا السلف والأنابيب البعيدة من الكليرونات الوليدة. هذا البروتوكول يسد فجوة في أبحاث الميكسونفروس. وهو نموذج حاسم لفهم كيفية تشكل أنسجة الكلى الجديدة والاندماج مع الكلية الموجودة وتوفير رؤى في العلاجات التجديدية.

Introduction

جنين حمار وحشي هو نموذج مهم لدراسة تطور الأنسجة بسبب صغر حجمه وشفافيته وأدواته المتاحة وبقائه دون تغذية لمدة تصل إلى خمسة أيام1,2. وقد ساهم بشكل كبير في فهم نمو الكلى والحفاظ على بين حمار وحشي والثدييات3،4،5. تلعب الكلية دورا أساسيا في الحفاظ على التوازن السائل ، وتصفية الدم ، وإفراز النفايات6. وتتألف الكلية، وهي الوحدة الوظيفية للكلى، من فلتر دم متصل بأنابيب طويلة. في حمار وحشي، اثنين من هياكل الكلى تشكل طوال حياتها. تتشكل الفروس (الكلية الجنينية المؤقتة) أولا أثناء النمو المبكر. وهو يتألف من اثنين من الكلية التي تعمل على طول المحور الأمامي الخلفي ويصبح وظيفيا في حوالي 2 أيام بعد الإخصاب (dpf). تكمن فائدة الفروس في بساطته ، حيث يبدأ اثنان فقط من الكليرونات التي هي في الغالب خطية وسهلة التصور (على الرغم من أن أنبوب الأنبوب الملتوي القريب يبدأ في اللف عند ثلاثة dpf)3. وقد سهل هذا ليس فقط دراسات تطورها المبكر من mesoderm المتوسطة، ولكن أيضا نمط التقسيم وإصلاح أنبوبي7،8.

تصبح فائدة سمك الحمار الوحشي محدودة بعد خمسة dpf ، عندما يتضاءل الصفار وتعتمد اليرقات على التغذية في النظام المائي9. في حوالي 2 أسابيع من العمر ، تخضع اليرقات للتحول إلى أحداث ، حيث تتشكل أنسجة جديدة وتضيع الأنسجة القديمة و / أو إعادة تنظيم9. هذا هو أيضا عندما mesonephros (الكلى الكبار الدائم) تشكل10،11،12. يتشكل أول نييفرون بالغ بالقرب من السوسميت السادس ، ويندمج مع أنبوب الأنابيب المبكر البعيدة من النضال. تتم إضافة نييفرونات إضافية إلى هذا الموقف في البداية ، ولكن أيضا نحو الأمامي في وقت لاحق. تندمج الكليرونات الأولية في هذه الموجة الأولى في أنابيب التينفروس وتشترك في تجويف مشترك لإيداع نفاياتها. تتشكل الكلية الثانوية في الموجة التالية ويندمج في الكليرونات الأولية. هذه العملية تكرار يخلق mesonephros التي تتفرع، إلى حد ما أقرب إلى الكلى الثدييات. يفترض، وs pronephros يفقد في نهاية المطاف هويته أنبوبي ويصبح اثنين من قنوات جمع الرئيسية حيث جميع nephrons استنزاف النفايات الخاصة بهم13.

قبل تشكيل أول نسل نيفيرون بالغ ، تبدأ خلايا السلف المفردة في الظهور في يرقات ~4 مم (الطول الإجمالي) (~ 10 ديسيبل في البرونيل). هذه الخلايا، التي تم وضع علامة في خط TG (lhx1a-EGFP) المعدلة وراثيا، تلتزم المعرضة ويبدو أن الهجرة إلى مواقع مستقبلية من تولد الكلية. تتجمع الخلايا المفردة في مجموعات، والتي تفرق إلى nephrons12 جديدة. ومن غير الواضح أين تتواجد هذه الخلايا أو ما هي الجينات التي تعبر عنها قبل بداية تكوين الميسونيفروجين.

فهم تطور mesonephros يوفر رؤى في الكلى الثدييات بطرق لا يمكن أن المعرضة. وتشمل هذه تشكيل المجاميع الكلية من خلايا السلف واحد، والتكامل الوظيفي للنيفرونات الجديدة مع تلك الموجودة، والمورفوجين المتفرعة. ومع ذلك ، هناك قيود على دراسة التنمية بعد الطمث. اليرقات أقل شفافية بسبب حجمها الأكبر وجود تصبغ. والجدول الزمني للنمو غير متزامن بين فرادى الحيوانات ويعتمد اعتمادا كبيرا على العوامل البيئية، مثل التغذية والزحام 9،14. على الرغم من وجود الكواشف القاضية ، إلا أنها أقل فعالية في اليرقات مقارنة بالأجنة15. في هذا البروتوكول، يتم وصف طريقة التهجين في الموقع لتحديد التعبير الجيني أثناء تطوير سمك الحمار الوحشي mesonephros. يتم تحسين عدة خطوات لزيادة التصور من mesonephros والاختراق وغسل المسبار والأجسام المضادة. يستخدم خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا جنبا إلى جنب مع مسبار ل EGFP لتسمية خلايا السلف المفردة ، والمجاميع الكلية ، وأنابيب الكلية البعيدة من الكلية الوليدة. ستوفر هذه الطريقة فهما أعمق لتطوير mesonephros ونظرة ثاقبة في العلاجات التجديدية.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام يرقات ويرقات حمار وحشي من قبل IUP IACUC (البروتوكول رقم 02-1920، #08-1920). يتم سرد تفاصيل محتوى الحل في جدول المواد. 1. تربية اليرقات ملاحظة: يستغرق رفع اليرقات والأحداث إلى مرحلة الاهتمام ما يصل إلى 21 يوما أو أكثر. إعداد حمار وحشي ا?…

Representative Results

باستخدام خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا ، ثبت أن هذا البروتوكول التهجين في الموقع فعال في وضع العلامات على خلايا السلف الكلوي وهياكل الكلية المختلفة أثناء تطوير الميكسونفروس. كما هو متوقع، يتم تسمية الجهاز العصبي المركزي أيضا في هذا الخط المعدلة وراثيا (لا يظهر). أشكال الكلية mesonephric ا…

Discussion

تهدف طريقة التهجين في الموقع الموصوفة هنا إلى دراسة تطوير الميكونيفروس. ومع ذلك ، يمكن تطبيقه لدراسة تطور الأنسجة والأعضاء الأخرى أثناء التحول ، مثل الأمعاء والجهاز العصبي والمقاييس والتصبغ14. يمكن إنشاء مسابير للجينات الذاتية أو علامات الفلورسنت في خطوط معدلة وراثيا.</p…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم توفير التمويل من قبل أكاديمية بنسلفانيا للعلوم، وكومنولث علماء الأحياء في بنسلفانيا، وجامعة إنديانا في بنسلفانيا (كلية الدراسات العليا والبحوث، وقسم البيولوجيا، وصندوق سينثيا سوشاك للبيولوجيا الجامعية للتميز). تم توفير خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا من قبل الدكتور نيل هوكريدي (جامعة بيتسبرغ).

Materials

Anti-fluorescein antibody Roche/Sigma-Aldrich 11426338910
Bleaching solution 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST
Blocking reagent Roche/Sigma-Aldrich 11096176001 Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction
Cell strainer Fisher Scientific  22-363-549 100 μm
E3 medium 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue
Eyelash manipulator Fisher Scientific NC1083208 Use to manipulate larvae
Fixing solution 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down
Fluorescein probe synthesis Roche/Sigma-Aldrich 11685619910
Glass vial Fisher Scientific 03-338B
Hatchfry encapsulation Argent
Hyb- solution 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20
Hyb+ solution HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin
MAB (10X) 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5
MABT 1X MAB, 0.1% Tween-20
Maleic acid Sigma-Aldrich M0375
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
PBS (10X) 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4
PBST 1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST2 1X PBS, 0.2% Tween-20
Powder food Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well
Proteinase K Sigma-Aldrich P5568 Use to permeabilize larvae
Proteinase K solution 20  μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST
Spirulina microfine powder Argent
SSC (20X) 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave
SSCT (0.2X) Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
SSCT (2X) Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
Staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20
Staining solution 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer
Stopping solution 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST
Torula (yeast) RNA Sigma-Aldrich R6625
Tricaine Sigma Aldrich E10521 2%, pH 7
Wash buffer 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20

Referências

  1. Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
  2. Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish – emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
  3. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  4. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
  5. Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
  6. Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
  7. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
  8. Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
  9. McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
  10. Diep, C. Q., et al. Development of the zebrafish mesonephros. Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).
  11. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
  12. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
  13. Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., Cartner, S. C. . The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. , 145-150 (2020).
  14. Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  15. Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
  16. Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
  17. Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Biologia do Desenvolvimento. 256 (2), 221-241 (2003).
  18. Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
  19. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).

Play Video

Citar este artigo
Kasar, S. N., Grandinette, S. A., Semelsberger, S. D., Diep, C. Q. In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development. J. Vis. Exp. (174), e62930, doi:10.3791/62930 (2021).

View Video