Summary

İnsan Preimplantasyon Embriyolarının Harcanan Kültür Ortamı Kullanılarak Kromozom Taraması: Örnek Toplama ve Kromozomal Ploidi Analizi

Published: September 07, 2021
doi:

Summary

Bu çalışma, embriyo biyopsisini önleyen ve NGS kullanılarak kromozom ploidi tanımlamasını sağlayan, harcanan kültür ortamını kullanan insan embriyolarının kromozom taraması için bir protokol bildirmektedir. Bu makale, kültür ortamının hazırlanması, tüm genom amplifikasyonu (WGA), yeni nesil dizileme (NGS) kütüphanesinin hazırlanması ve veri analizi dahil olmak üzere ayrıntılı prosedürü sunmaktadır.

Abstract

Klinik in vitro fertilizasyonda (IVF), PGT-A için geçerli yöntem, trofektodermden (TE) birkaç hücrenin biyopsisini gerektirir. Bu, plasentayı oluşturan soydur. Bununla birlikte, bu yöntem özel beceriler gerektirir, invazivdir ve yanlış pozitiflerden ve negatiflerden muzdariptir, çünkü TE’deki kromozom sayıları ve fetüse dönüşen iç hücre kütlesi (ICM) her zaman aynı değildir. Hem TE hem de ICM’den kültür ortamına salınan DNA’nın dizilenmesini gerektiren bir teknoloji olan NICS, bu sorunlara bir çıkış yolu sunabilir, ancak daha önce sınırlı etkinliğe sahip olduğu gösterilmiştir. Bu çalışma, kültür ortamı örnekleme yöntemlerini, tüm genom amplifikasyonunu (WGA) ve kütüphane hazırlığını ve analiz yazılımı ile NGS veri analizini içeren NICS’nin tam protokolünü bildirmektedir. Farklı embriyo laboratuvarlarındaki farklı kriyoprezervasyon süreleri göz önüne alındığında, embriyologların IVF laboratuvarının gerçek koşullarına göre seçilebilecek embriyo kültürü ortamını toplamak için iki yöntemi vardır.

Introduction

Yardımcı üreme teknolojileri (ART’ler) infertilite tedavisinde giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, IVF gibi ART’nin başarı oranı sınırlı kalmıştır ve gebelik kaybı oranı normal popülasyondan önemli ölçüde daha yüksektir1. Bu sorunların ana nedeni, preimplantasyon insan embriyolarında yaygın olarak bulunan kromozomal anormalliklerdir2. PGT-A, implantasyondan önce embriyoları kromozomal denge açısından taramak için etkili bir yöntemdir 3,4. Bazı çalışmalar PGT-A’nın düşük oranını azaltabileceğini ve gebelik oranını artırabileceğini kanıtlamıştır 5,6,7,8. Bununla birlikte, PGT-A, özel eğitim ve deneyim gerektiren karmaşık teknik uzmanlık gerektirir. İnvaziv embriyo biyopsisi prosedürü de potansiyel olarak embriyolara zarar verebilir9. Çalışmalar, blastomer biyopsisinin sonraki gelişimi engelleyebileceğini ve biyopsi yapılan TE’lerin sayısının implantasyon oranlarını etkileyebileceğini göstermiştir10. Embriyo biyopsisinin uzun dönem biyogüvenlik konusu insanlarda henüz tam olarak değerlendirilmemiş olsa da, hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar embriyo gelişimi üzerindeki olumsuz etkilerini göstermiştir11,12,13.

Önceki raporlar, embriyo gelişimi sırasında kültür ortamına eser miktarda DNA materyali salgılandığını ve kullanılmış embriyo kültür ortamı 14,15,16,17,18 kullanılarak kapsamlı kromozom taraması (CCS) yapmak için çaba gösterildiğini göstermiştir. Bununla birlikte, tespit oranları ve testlerin doğruluğu, kapsamlı klinik kullanım gereksinimlerini karşılamamıştır. Bu çalışma, NICS testinin doğruluğunun yanı sıra tespit oranlarını artırmak için NICS testinde bir iyileşme olduğunu bildirmiştir19. Son yıllarda, blastokoele sıvısı (BF), minimal invaziv PGT-A’nın analitik bir örneği olarak incelenmiştir. Bununla birlikte, blastosist sıvısı örneklerinde başarılı genom çapında amplifikasyon ve saptanabilir DNA oranı %34,8 ile %82 arasında değişmektedir20,21,22. Çeşitli çalışmalarda bildirilen BF hacmi 0.3 nL ila 1 μL arasında değişmektedir. BF’deki düşük DNA miktarı göz önüne alındığında, tespitin başarı oranını ve tutarlılığını artırmak için blastosist sıvısı ve kültür ortamını karıştırarak hücresiz DNA miktarını artırmak mümkündür. Kuznyetsov ve ark.23 ve Li ve ark.24, zona pellucida’yı bir lazerle tedavi etti ve toplam embriyonik DNA miktarını iyileştirmek için blastosist sıvısını kültür ortamına saldı ve WGA’dan sonra kombine ortam/BF örneklerinin amplifikasyon oranı sırasıyla %100 ve %97.5 idi. Jiao ve ark.25 de aynı yöntemi kullanarak %100 amplifikasyon başarı oranı elde etmiştir.

Bu çalışma, harcanan ortam örneği hazırlama, NGS hazırlama ve veri analizini içeren ayrıntılı bir protokol bildirmektedir. Bu çalışmada oositlerden kümülüs hücreleri dikkatlice çıkarılarak intrasitoplazmik tek sperm enjeksiyonu (ICSI) ve blastosist kültürü uygulandı. 4. gün 5/6. gün WGA ve NGS kütüphane hazırlığı için orta toplandı. Bu çalışmada NICS teknolojisi kullanılarak WGA ve NGS kütüphanesi hazırlama adımları yaklaşık 3 saatte kolaylaştırılmış ve CCS sonuçları yaklaşık 9 saat içinde noninvaziv olarak elde edilmiştir.

Protocol

Pekin Üniversitesi Üçüncü Hastanesi Etik Kurulu’ndan etik izin alınmıştır. 1. Hazırlık NOT: Gerekli malzeme ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Reaktif20-30 μL gamet ortamı/döllenme ortamı ve bölünme/blastosist aşaması kültür ortamı (mineral yağ ile kaplı) ve hyaluronidaz (sıkıca kapatılmış bir tüp içinde) 37 °C’de, %5 CO2 ve% 5 O2’de önceden ısıtın ve dengeley…

Representative Results

Bu çalışmada önerilen yöntem bir hastaya uygulanmıştır. NICS analizi uygulanmadan önce KİB onayı ve bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Bu çalışmada hastalardan 6 blastosist elde edildi ve 6 embriyonun hepsinde 4. günden 5. güne kadar NICS uygulandı. Ebeveynlerin dengeli translokasyonunun neden olduğu kromozom anormallikleri, NICS testi ile kromozomların beşinde tespit edildi; bu nedenle transfer için kullanılamazlar (Şekil 4A-E). İki embriyonun NI…

Discussion

Değişiklikler ve sorun giderme

NICS sonuçları ebeveyn genetik materyalleri ile kontamine olmuşsa, tüm kümülüs-korona radiata hücrelerinin çıkarıldığından emin olun ve döllenme için ICSI yapıldığından emin olun. DNA’yı bozabilecek uygun olmayan ortam depolama veya şablon hazırlama işlemlerinden kaçınılır. Çalışma alanı DNase ve RNase dekontaminasyon reaktifleri ile iyice saflaştırıldı. Diğer embriyolardan kontaminasyonu önlemek için, 4. …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, NGS veri analizindeki yardımları için Shiping Bo ve Shujie Ma’ya teşekkür eder. Finansman: Bu çalışma Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (Hibe No. 2018YFC1003100) tarafından desteklenmiştir.

Materials

1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube Axygen MCT-150-C, PCR-02-C DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended.
10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips Axygen T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S This can be replaced by other brand/For sample transfer
100 % ethanol Sinopharm Chemical 10009218 This can be replaced by other brand/For DNA library purification
Barcode Primer1-48 Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile BD Bioscience 363037 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile BD Bioscience 353001 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile BD Bioscience 353002 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Cell Lysis Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
Cell Lysis Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
ChromGo software Yikon Genomics Data analysis
CMPure Magbeads Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library purification
Cryotop open systerm  KITAZATO BioPharma 81110 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Distill water Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit To dissolve DNA
ES (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
HOLDNIG ORIGIO MPH-MED-35 This can be replaced by other
brand/For ICSI
Hyaluronidase solution, 80 U/mL SAGE ART4007-A This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex
ICSI ORIGIO MPH-35-35 This can be replaced by other brand/For ICSI
Illumina MiSeq® System Illumina SY-410-1001 For library sequencing
Incubator Labotect Inkubator C16 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Library buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Library Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Magnetic Stand DynaMagTM-2 12321D For library purification
Microscope OLYMPUS 1X71 This can be replaced by other brand/For embryo observation
Mini-centrifuge ESSENSCIEN ELF6 For separation
MT Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
NICSInst library preparation kit Yikon Genomics KT1000800324 Whole genome amplification and library construction
NICSInst Sample Prep Station Yikon Genomics  ME1001003 Amplificate DNA
Nunc IVF 4-Well Dish Thermo Scientific 144444 This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture
Pasteur Pipette Oirgio  MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For embryo tansfer
Pasteur pipettes ORIGIO PP-9-1000 This can be replaced by other brand/For IVF laboratory
Pre-Lib Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Pre-Lib Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Qubit® 3.0 Fluorometer Thermo Scientific Q33216 For library quantification
Quinn's Advantage Blastocyst Medium SAGE ART-1029 For embryo blastocyst stage culture
Quinn's Advantage Cleavage Medium SAGE ART-1026 This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture
Quinn's Advantage Fertilization Medium SAGE ART-1020 This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization
Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES SAGE ART-1023 This can be replaced by other brand/For embryo clutrure
Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit SAGE ART-3010 This can be replaced by other brand/To denude the oocyte
Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil SAGE ART-4008P This can be replaced by other brand/To cover the culture medium
STRIPPER TIPS ORIGIO MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells
Vitrification Cryotop Open systerm KIZTAZATO 81111 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vitrification kit  KITAZATO BioPharma VT101 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vortexer Qilinbeier DNYS8 Sample mix
VS (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
ZILOS-tk Laser System Hamilton Thorne CLASS 1 laser This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse

Referências

  1. Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
  2. Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationship to morphology and development of human embryos. Reproductive BioMedicine Online. 12 (2), 234-253 (2006).
  3. Harton, G. L. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertility and Sterility. 100 (6), 1695-1703 (2013).
  4. Hodes-Wertz, B. Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos. Fertility and Sterility. 98 (3), 675-680 (2012).
  5. Keltz, M. D. Preimplantation genetic screening (PGS) with Comparative genomic hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1333-1339 (2013).
  6. Scott, R. T. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 697-703 (2013).
  7. Forman, E. J. In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (1), 100-107 (2013).
  8. Yang, Z. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 5 (1), 24 (2012).
  9. Cimadomo, D. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. BioMed Research International. 2016, 7193075 (2016).
  10. Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  11. Wu, Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (9), 1761-1774 (2014).
  12. Zhao, H. C. Aberrant epigenetic modification in murine brain tissues of offspring from preimplantation genetic diagnosis blastomere biopsies. Biology of Reproduction. 89 (5), 117 (2013).
  13. Zeng, Y. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) influences adrenal development and response to cold stress in resulting mice. Cell and Tissue Research. 354 (3), 729-741 (2013).
  14. Palini, S. Genomic DNA in human blastocoele fluid. Reproductive BioMedicine Online. 26 (6), 603-610 (2013).
  15. Gianaroli, L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).
  16. Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation. Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).
  17. Stigliani, S. Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).
  18. Wu, H. Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA. Medicina. 94 (12), e669 (2015).
  19. Xu, J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).
  20. Capalbo, A. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  21. Tobler, K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).
  22. Magli, M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid?. Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).
  23. Kuznyetsov, V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One. 13 (5), e0197262 (2018).
  24. Li, P. Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization. Scientific Reports. 8 (1), 9275 (2018).
  25. Jiao, J. Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium. Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).
  26. Palermo, G. D. Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter’s syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).
  27. Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).
  28. . Qubit dsDNA HS Assay Kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product (2015)
  29. . Miseq system use guide Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_system (2016)
  30. Lane, M. Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo. Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).
  31. Rubio, C. Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).
  32. Rubio, C. Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications. Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).
  33. Lledo, B. Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis. Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).
  34. Kuznyetsov, V. Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay. Scientific Reports. 10 (1), 7244 (2020).

Play Video

Citar este artigo
Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu, X., Ma, J., Wang, J., Liu, P., Lu, S. Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62619, doi:10.3791/62619 (2021).

View Video