בדיקת כרומוזומים של עוברים אנושיים טרום השרשה באמצעות מדיום תרבית משומש: איסוף דגימות וניתוח פלואידיות כרומוזומליות
Summary
המחקר הנוכחי מדווח על פרוטוקול לבדיקת כרומוזומים של עוברים אנושיים המשתמש במדיום תרבית משומש, המונע ביופסיה של עוברים ומאפשר זיהוי כרומוזום פלואידי באמצעות NGS. המאמר הנוכחי מציג את ההליך המפורט, כולל הכנת מדיום תרבית, הגברה של גנום שלם (WGA), הכנת ספריית ריצוף הדור הבא (NGS) וניתוח נתונים.
Abstract
בהפריה חוץ גופית קלינית (IVF), השיטה הרווחת עבור PGT-A דורשת ביופסיה של כמה תאים מהטרופקטודרם (TE). זוהי השושלת היוצרת את השליה. שיטה זו, לעומת זאת, דורשת מיומנויות מיוחדות, היא פולשנית, וסובלת מתוצאות חיוביות ושליליות שגויות מכיוון שמספרי הכרומוזומים ב- TE ומסת התא הפנימית (ICM), המתפתחת לעובר, אינם תמיד זהים. NICS, טכנולוגיה הדורשת ריצוף של דנ”א המשתחרר למדיום התרבית הן מ-TE והן מ-ICM, עשויה להציע מוצא לבעיות אלה, אך הוכחה בעבר כבעלת יעילות מוגבלת. המחקר הנוכחי מדווח על הפרוטוקול המלא של NICS, הכולל שיטות דגימה בינוניות בתרבית, הגברה של גנום שלם (WGA) והכנת ספריות, וניתוח נתוני NGS באמצעות תוכנת ניתוח. בהתחשב בזמני ההקפאה השונים במעבדות עוברים שונות, לאמבריולוגים יש שתי שיטות לאיסוף מדיום תרבית עוברים שניתן לבחור על פי התנאים בפועל של מעבדת הפריה חוץ גופית.
Introduction
טכנולוגיות רבייה בסיוע (ARTs) שימשו יותר ויותר לטיפול באי פוריות. עם זאת, שיעור ההצלחה של ART, כגון הפריה חוץ גופית, היה מוגבל, ושיעור אובדן ההריון גבוה משמעותית מזה של האוכלוסייה הרגילה1. הגורם העיקרי לבעיות אלה הוא הפרעות כרומוזומליות, הקיימות בדרך כלל בעוברים אנושיים טרום השרשה2. PGT-A היא שיטה יעילה לבדיקת עוברים לאיזון כרומוזומלי לפני השרשה 3,4. כמה מחקרים הוכיחו כי PGT-A יכול להפחית את שיעור ההפלות ולשפר את שיעור ההריון 5,6,7,8. עם זאת, PGT-A דורש מומחיות טכנית מורכבת הדורשת הכשרה וניסיון ספציפיים. הליך ביופסיית העובר הפולשני עלול גם לגרום נזק לעוברים9. מחקרים הראו כי ביופסיית בלסטומרים יכולה לעכב את ההתפתחות הבאה, ומספר הביופסיות עשוי להשפיע על שיעורי ההשתלה10. למרות שנושא הבטיחות הביולוגית ארוכת הטווח של ביופסיית עוברים עדיין לא נבדק ביסודיות בבני אדם, מחקרים בבעלי חיים הראו את ההשפעות השליליות שלה על התפתחות העובר11,12,13.
דיווחים קודמים הצביעו על כך שכמויות זעירות של חומרי דנ”א הופרשו למדיום התרבית במהלך התפתחות העובר, ונעשו מאמצים לבצע בדיקת כרומוזומים מקיפה (CCS) באמצעות תרבית עוברים משומשת 14,15,16,17,18. עם זאת, שיעורי הגילוי והדיוק של הבדיקות לא עמדו בדרישות לשימוש קליני נרחב. המחקר הנוכחי דיווח על שיפור בבדיקת NICS להגדלת שיעורי האיתור, כמו גם את הדיוק של מבחן NICS19. בשנים האחרונות, נוזל בלסטוקוele (BF) נחקר כמדגם אנליטי של PGT-A זעיר פולשני. עם זאת, שיעור ההגברה המוצלחת של הגנום כולו והדנ”א הניתן לזיהוי בדגימות נוזל בלסטוציסט נע בין 34.8% ל-82%20,21,22. נפח ה-BF המדווח במחקרים שונים נע בין 0.3 nL ל-1 μL. לאור הכמות הנמוכה של DNA ב- BF, ניתן להגדיל את כמות ה- DNA ללא תאים על ידי ערבוב נוזל בלסטוציסט ומדיום תרבית כדי לשפר את שיעור ההצלחה ואת עקביות האיתור. Kuznyetsov et al.23 ו-Li et al.24 טיפלו בזונה פלוצ’ידה בלייזר ושחררו נוזל בלסטוציסט למדיום התרבית כדי לשפר את הכמות הכוללת של דנ”א עוברי, וקצב ההגברה של דגימות בינוניות/BF משולבות לאחר WGA היה 100% ו-97.5%, בהתאמה. Jiao et al.25 השיגו גם שיעור הצלחה של 100% הגברה באמצעות אותה שיטה.
המחקר הנוכחי מדווח על פרוטוקול מפורט הכולל הכנת דגימות מדיה משומשות, הכנת NGS וניתוח נתונים. על ידי הסרה זהירה של תאי קומולוס מביציות, המחקר הנוכחי ביצע הזרקת זרע יחיד תוך ציטופלזמית (ICSI) ותרבית בלסטוציסט. היום, 4 ימים 5/יום 6 בילה בינוני נאסף להכנת ספריית WGA ו- NGS. על ידי שימוש בטכנולוגיית NICS, המחקר הנוכחי ייעל את שלבי הכנת ספריית WGA ו- NGS תוך כ -3 שעות והשיג תוצאות CCS באופן לא פולשני תוך כ -9 שעות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שינויים ופתרון בעיות
אם תוצאות NICS מזוהמות בחומרים גנטיים של ההורים, יש לוודא שכל תאי הקומולוס-קורונה רדיאטה מוסרים ולוודא כי ICSI מבוצע לצורך הפריה. נמנעים מאחסון בינוני לא תקין או מתהליכי הכנת תבניות, מה שעלול לפגוע בדנ”א. חלל העבודה טוהר ביסודיות עם ריאגנטים לטיהור…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות ל-Shiping Bo ול-Shujie Ma על עזרתם בניתוח נתוני NGS. מימון: עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח (מענק מס’ 2018YFC1003100).
Materials
| 1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended. |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips | Axygen | T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S | This can be replaced by other brand/For sample transfer |
| 100 % ethanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | This can be replaced by other brand/For DNA library purification |
| Barcode Primer1-48 | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile | BD Bioscience | 363037 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile | BD Bioscience | 353001 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile | BD Bioscience | 353002 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Cell Lysis Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| Cell Lysis Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| ChromGo software | Yikon Genomics | Data analysis | |
| CMPure Magbeads | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library purification |
| Cryotop open systerm | KITAZATO BioPharma | 81110 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Distill water | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | To dissolve DNA |
| ES (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Hyaluronidase solution, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | This can be replaced by other brand/For ICSI |
| Illumina MiSeq® System | Illumina | SY-410-1001 | For library sequencing |
| Incubator | Labotect | Inkubator C16 | This can be replaced by other brand/For embryo culture |
| Library buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Library Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For library amplificaton |
| Magnetic Stand | DynaMagTM-2 | 12321D | For library purification |
| Microscope | OLYMPUS | 1X71 | This can be replaced by other brand/For embryo observation |
| Mini-centrifuge | ESSENSCIEN | ELF6 | For separation |
| MT Enzyme Mix | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | For culture medium pre-treatment |
| NICSInst library preparation kit | Yikon Genomics | KT1000800324 | Whole genome amplification and library construction |
| NICSInst Sample Prep Station | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificate DNA |
| Nunc IVF 4-Well Dish | Thermo Scientific | 144444 | This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture |
| Pasteur Pipette | Oirgio | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For embryo tansfer |
| Pasteur pipettes | ORIGIO | PP-9-1000 | This can be replaced by other brand/For IVF laboratory |
| Pre-Lib Buffer | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Pre-Lib Enzyme | Yikon Genomics | Reagent in NICSInst library preparation kit | Pre-library preparation |
| Qubit® 3.0 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | For library quantification |
| Quinn's Advantage Blastocyst Medium | SAGE | ART-1029 | For embryo blastocyst stage culture |
| Quinn's Advantage Cleavage Medium | SAGE | ART-1026 | This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture |
| Quinn's Advantage Fertilization Medium | SAGE | ART-1020 | This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES | SAGE | ART-1023 | This can be replaced by other brand/For embryo clutrure |
| Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit | SAGE | ART-3010 | This can be replaced by other brand/To denude the oocyte |
| Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil | SAGE | ART-4008P | This can be replaced by other brand/To cover the culture medium |
| STRIPPER TIPS | ORIGIO | MXL3-IND-135 | This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells |
| Vitrification Cryotop Open systerm | KIZTAZATO | 81111 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vitrification kit | KITAZATO BioPharma | VT101 | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Sample mix |
| VS (Vitrification kit) | KITAZATO BioPharma | Reagent inVitrification kit | This can be replaced by other brand/For embryo vitrification |
| ZILOS-tk Laser System | Hamilton Thorne | CLASS 1 laser | This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse |
Referências
- Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
- Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationship to morphology and development of human embryos. Reproductive BioMedicine Online. 12 (2), 234-253 (2006).
- Harton, G. L. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertility and Sterility. 100 (6), 1695-1703 (2013).
- Hodes-Wertz, B. Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos. Fertility and Sterility. 98 (3), 675-680 (2012).
- Keltz, M. D. Preimplantation genetic screening (PGS) with Comparative genomic hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1333-1339 (2013).
- Scott, R. T. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 697-703 (2013).
- Forman, E. J. In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (1), 100-107 (2013).
- Yang, Z. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 5 (1), 24 (2012).
- Cimadomo, D. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. BioMed Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Wu, Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (9), 1761-1774 (2014).
- Zhao, H. C. Aberrant epigenetic modification in murine brain tissues of offspring from preimplantation genetic diagnosis blastomere biopsies. Biology of Reproduction. 89 (5), 117 (2013).
- Zeng, Y. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) influences adrenal development and response to cold stress in resulting mice. Cell and Tissue Research. 354 (3), 729-741 (2013).
- Palini, S. Genomic DNA in human blastocoele fluid. Reproductive BioMedicine Online. 26 (6), 603-610 (2013).
- Gianaroli, L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).
- Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation. Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).
- Stigliani, S. Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).
- Wu, H. Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA. Medicina. 94 (12), e669 (2015).
- Xu, J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).
- Capalbo, A. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Tobler, K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).
- Magli, M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid?. Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).
- Kuznyetsov, V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One. 13 (5), e0197262 (2018).
- Li, P. Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization. Scientific Reports. 8 (1), 9275 (2018).
- Jiao, J. Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium. Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).
- Palermo, G. D. Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter’s syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).
- Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).
- . Qubit dsDNA HS Assay Kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product (2015)
- . Miseq system use guide Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_system (2016)
- Lane, M. Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo. Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).
- Rubio, C. Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).
- Rubio, C. Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications. Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).
- Lledo, B. Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis. Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).
- Kuznyetsov, V. Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay. Scientific Reports. 10 (1), 7244 (2020).
