Detta protokoll ger steg från DNA-extraktion till experimentell uppsättning för digital dropp PCR (ddPCR), inklusive analys för identifiering och kvantifiering av icke-homologa end-joining (NHEJ) händelser på målplatser efter gRNA-inducerad Cas9 klyvning och DNA-reparation. Andra användningsområden för denna metod inkluderar applikationer som polymorfismdetektering och genredigeringsvariantverifiering.
De senaste framstegen inom mygggenomik och genteknik har främjat ett behov av snabba och effektiva metoder för att upptäcka riktad DNA-sekvensvariation i stor skala. Specifikt är det viktigt att upptäcka infogningar och borttagningar (indels) på genredigerade platser som genereras av CRISPR guide RNA (gRNA)/Cas9-medierad icke-homolog end-joining (NHEJ) för att bedöma mutagenes trohet och frekvensen av oavsiktliga förändringar. Vi beskriver här ett protokoll för digital-droplet PCR (ddPCR) som är väl lämpad för NHEJ-analys med hög genomströmning. Även om den här metoden inte producerar data som identifierar individuell sekvensvariation, ger den en kvantitativ uppskattning av sekvensvariationen inom en population. Dessutom, med lämpliga resurser, kan detta protokoll implementeras i en fält-plats laboratorie inställning lättare än nästa generations eller Sanger sekvensering. ddPCR har också en snabbare vändningstid för resultat än någon av dessa metoder, vilket möjliggör en snabbare och mer fullständig analys av genetisk variation i vilda populationer under fältförsök av genetiskt modifierade organismer.
Gendrivare har en enorm potential att kontrollera insektspopulationer av medicinsk och jordbruksrelevans1,2,3,4,5. Till exempel kan gendrivna system baserade på CRISPR Cas nukleaser och guide RNAs (gRNAs) användas för att modifiera vektormyggpopulationer genom att införa egenskaper som ger refraktoritet till malariaparasiter vilket leder till minskad överföring och mindre sjukdom1,4,5. Gendrivsystemet kopierar sig själv och det tillhörande draget från en homolog kromosom till en annan i de pre meiotiska könscellerna, och detta säkerställer att majoriteten av avkomman ärver enheten och skapar potential för långvarig och hållbar populationsmodifiering i fältet. En nackdel med Cas/gRNA-baserade metoder är dock möjligheten att generera infognings- och raderingsmutationer (indel) genom icke-homolog end-joining (NHEJ) DNA-reparation, vilket resulterar i generering av drivbeständiga alleler, som när de ackumuleras till en tillräckligt hög frekvens i befolkningen kan stoppa drivsystemet från att spridasig 1,2,3,4 . Detta protokoll beskriver en hög genomströmning och tillförlitlig metod som kan bestämma prevalensen och den relativa mängden indelmutationer, på både befolknings- och individnivå, under Cas/gRNA-baserad gendrift.
Nästa generations sekvenseringsmetoder (NGS) ger oöverträffad sekvenseringsupplösning. De kostnader och tekniska krav som är förknippade med NGS förbjuder dock rutintester och begränsar dess användning som en metod med hög genomströmning för att bedömaindels 6,7,8. Traditionella PCR-kvantifieringsmetoder har länge använts som standardutvärderingsförfarande för genom indels. Dessa metoder är dock arbetsintensiva, tar lång tid att skaffa data och har en hög grad av variabilitet. Digital-Droplet PCR (ddPCR) har visat sig vara känsligare för att upptäcka mutationer än Sanger sekvensering i vissa applikationer och har en lägre detektionsgräns än NGS i andra6,7,8,9. Dessutom är kostnaden för att bedöma en provuppsättning och vändningstid för att uppnå resultat billigare respektive snabbare för ddPCR än antingen Sanger-sekvensering eller NGS9. Med hjälp av ett dubbelsondsystem identifierar drop-off-analysen NHEJ-alleler baserat på frånvaron av WT-sekvens (wild-type) vid den gRNA-riktade mål cas9-klippplatsen. I denna analys förstärks en kort amplicon inklusive den förväntade skärplatsen för Cas/gRNA-baserade systemet med ett specifikt primerpar. En fluorescerande sond är utformad för att binda till en bevarad region av amplicon och en annan fluorescerande sond känner igen WT-sekvensen av klippplatsen. I närvaro av en NHEJ-allel kommer den senare inte att binda till ampliconen.
Användningen av ddPCR ger möjlighet att designa primers för att rikta borttagningar, skillnader och infogningar med ett enda baspar, vilket möjliggör NHEJ-profilering i myggpopulationsanalyser9. Med tanke på dessa attraktiva funktioner skapade vi ett protokoll för ddPCR för hög genomströmningsdetektering av indel som genereras från ett Cas/ gRNA-baserat gendrivsystem i myggor.
Digital-droplet PCR är en effektiv metod för att bestämma förekomsten av indel alleler som härrör från NHEJ-händelser i ett Cas/gRNA-baserat gendrivsystem och möjliggör kvantifiering av frekvensen av dessa alleler hos individer eller populationer. Vissa steg i protokollet måste följas med särskild omsorg för att uppnå tillförlitliga resultat. För det första måste den genomiska DNA-extraktionen utföras noggrant för att säkerställa hög kvalitet och tillräcklig kvantitet. En bra extraktion möjliggör korrekt bestämning av haploidgenomkopior per reaktion. Enligt vår erfarenhet tillhandahöll ett kommersiellt tillgängligt kit (se tabell över material)konsekvent högkvalitativa DNA-extraktioner. Extraktioner av enskilda myggor kan dock visa sig vara särskilt utmanande eftersom DNA-pelleten blir svår att visualisera och lätt kan sugas upp med supernatanten om inte försiktig. För det andra måste primers och sonder utformas noggrant. Innan du slutför ddPCR-experimentet, se till att de designade primers resulterar i en enda PCR-produkt genom att först utföra en traditionell PCR och visualisera en enda produkt via gelelektrofores. Referens-FAM-sonden måste också utformas så att den kompletterar en mycket bevarad sekvens. Detta kommer att säkerställa korrekta upptäckter av WT-alleler i en mångfaldig befolkning. Primer/sondkombinationerna för varje unikt experiment kommer att ha olika termocykelförhållanden, och det rekommenderas att optimera dessa förhållanden med hjälp av en termisk gradient.
Det finns andra metoder för att identifiera indels, till exempel Sanger-sekvensering eller NGS. Sanger-sekvensering är begränsad eftersom den har en lägre gräns för upptäckt och låg upptäcktskraft för att identifiera nya varianter. Sanger sekvensering är också arbetsintensiv och är inte hög genomströmning. Jämfört med Sanger-sekvensering har NGS inte samma begränsningar av låg känslighet, upptäcktskraft och dataflöde. En annan fördel med NGS är dess förmåga att upptäcka en mängd mutationer från enstaka nukleotidpolymorfism (SNPs) till omorganiseringar. NGS är dock en dyrare och tidskrävande metod vid tillämpning av att bestämma Cas9/gRNA-associerade indels eftersom det bara finns en målregion av intresse, och den är bäst lämpad för större genomomfattande analyser. Jämfört med de ovan nämnda metoderna är ddPCR hög genomströmning och har en snabb vändningstid. Om ddPCR-materialen och ddPCR-materialen finns tillgängliga internt kan 96 prover bearbetas inom 1-2 dagar, vilket gör det väl lämpat för snabb analys av stora försök av Cas9/gRNA-modifierade organismer.
Även om det finns många fördelar för ddPCR finns det också begränsningar. För det första är ddPCR-utrustningen inte ofta tillgänglig i en oberoende laboratoriemiljö. ddPCR-utrustning kan vara tillgänglig gemensamt vid större forskningsinstitutioner, men detta gör det inte möjligt att underlätta datagenerering och dataanalys utanför institutionen. För det andra, till skillnad från alternativen, ger ddPCR inte de enskilda unika sekvenserna av identifierade indelmutationer. Digital-droplet PCR kommer att ge frekvensen av indel mutationer inom en population, men utan sekvensen, man kan inte avgöra om de indels närvarande är mer benägna att bevara eller hämma funktionen av genen av intresse. DdPCR-metoden är kanske bäst lämpad att analysera vilda populationer efter en fältutgivningsstudie av en Cas9/gRNA-baserad drivorganism eftersom den effektivt kan bestämma frekvensen av introduktion av transgenen i den inhemska befolkningen och genereringen av indel inom befolkningen i nära realtid. På grund av ddPCR:s snabba vändningstid skulle det vara möjligt att utföra provtagning och analysera populationen i en fältförsöksregion varje vecka om material fanns tillgängligt lokalt. Startkostnaderna för att köpa, importera och installera ddPCR-utrustning skulle vara höga i fjärrlaboratorier, men fördelarna med att kunna bedöma en vild population noggrant eftersom den genomgår ändringar från ett drivsystem skulle motivera kostnaderna.
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen tillhandahölls av University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ är professor i Donald Bren vid University of California, Irvine.
Reagents | |||
ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
Materials | |||
ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
Equipment | |||
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |