Цифровая капельная ПЦР для выявления мутаций Indels в генетически модифицированных популяциях анофелиновых комаров
Summary
Этот протокол обеспечивает этапы от экстракции ДНК до экспериментальной установки для цифровой капельной ПЦР (ddPCR), включая анализ для идентификации и количественной оценки негомологичных событий конечного соединения (NHEJ) на целевых участках после гРНК-индуцированного расщепления Cas9 и репарации ДНК. Другие применения этого метода включают такие приложения, как обнаружение полиморфизма и проверка вариантов редактирования генов.
Abstract
Недавние достижения в области геномики комаров и технологий генной инженерии способствовали необходимости в быстрых и эффективных методах обнаружения целевых вариаций последовательности ДНК в больших масштабах. В частности, обнаружение вставок и делеций (indels) в генетически отредактированных сайтах, генерируемых направляющей РНК (гРНК) CRISPR / Cas9-опосредованной негомологичным конечным соединением (NHEJ), важно для оценки точности мутагенеза и частоты непреднамеренных изменений. Здесь мы описываем протокол для цифровой капельной ПЦР (ddPCR), который хорошо подходит для высокопроизводительного анализа NHEJ. Хотя этот метод не дает данных, которые идентифицируют отдельные вариации последовательности, он обеспечивает количественную оценку вариации последовательности в популяции. Кроме того, при наличии соответствующих ресурсов этот протокол может быть реализован в лабораторных условиях на полевой площадке легче, чем секвенирование следующего поколения или секвенирование Сэнгера. ddPCR также имеет более быстрое время обработки результатов, чем любой из этих методов, что позволяет более быстро и полно анализировать генетические вариации в диких популяциях во время полевых испытаний генетически модифицированных организмов.
Introduction
Генные драйвы обладают огромным потенциалом для контроля популяций насекомых медицинского и сельскохозяйственного значения1,2,3,4,5. Например, системы генного драйва на основе нуклеаз CRISPR Cas и направляющих РНК (гРНК) могут быть использованы для модификации популяций комаров-переносчиков путем введения признаков, которые придают огнеупорность малярийным паразитам, что приводит к снижению передачи и снижению заболеваемости1,4,5. Система генного драйва копирует себя и связанный с ней признак из одной гомологичной хромосомы в другую в премейотических половых клетках, и это гарантирует, что большинство потомства наследуют драйв и создают потенциал для длительной и устойчивой модификации популяции в полевых условиях. Однако одним из недостатков методов на основе Cas/gRNA является возможность генерации мутаций вставки и делеции (indel) посредством негомологичного восстановления ДНК с конечным соединением (NHEJ), что приводит к генерации резистентных к приводу аллелей, которые при накоплении достаточно высокой частоты в популяции могут остановить распространение системы привода1,2,3,4. . Этот протокол детализирует высокопроизводительный и надежный метод, который может определить распространенность и относительное количество мутаций indel, как на популяционном, так и на индивидуальном уровне, во время генного драйва на основе Cas / gRNA.
Методы секвенирования следующего поколения (NGS) обеспечивают беспрецедентное разрешение секвенирования. Однако стоимость и технические требования, связанные с NGS, запрещают рутинные испытания и ограничивают его использование в качестве высокопроизводительного метода оценки инделей6,7,8. Традиционные методы количественной оценки ПЦР уже давно используются в качестве стандартной процедуры оценки инделей генома; однако эти методы являются трудоемкими, требуют длительного времени для получения данных и имеют высокую степень изменчивости. Было доказано, что цифровая капельная ПЦР (ddPCR) более чувствительна при обнаружении мутаций, чем секвенирование Сэнгера в некоторых приложениях, и имеет более низкий предел обнаружения, чем NGS в других6,7,8,9. Кроме того, затраты на оценку набора образцов и время обработки для получения результатов дешевле и быстрее, соответственно, для ddPCR, чем секвенирование Сэнгера или NGS9. Используя систему с двумя зондами, анализ Drop-Off идентифицирует аллели NHEJ на основе отсутствия последовательности дикого типа (WT) в месте разреза мишени Cas9, направленной на гРНК. В этом анализе короткий ампликон, включающий предсказанный участок разреза системы на основе Cas/gRNA, усиливается определенной парой праймеров. Один флуоресцентный зонд предназначен для связывания с сохраненной областью ампликона, а другой флуоресцентный зонд распознает последовательность WT участка разреза. При наличии аллеля NHEJ последний не будет связываться с ампликоном.
Использование ddPCR обеспечивает возможность проектирования праймеров для целевых удалений, различий между одной парой оснований и вставок, что позволит профилировать NHEJ в анализах популяции комаров9. Учитывая эти привлекательные особенности, мы создали протокол для ddPCR для высокопроизводительного обнаружения инделей, генерируемых системой генного драйва на основе Cas/gRNA у комаров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цифровая капельная ПЦР является эффективным методом определения присутствия аллелей инделя, возникающих в результате событий NHEJ в системе генного драйва на основе Cas/gRNA, и позволяет количественно оценить частоту этих аллелей у отдельных лиц или популяций. Некоторые шаги протокола необходимо соблюдать с особой осторожностью для достижения надежных результатов. Во-первых, геномная экстракция ДНК должна быть выполнена тщательно, чтобы обеспечить высокое качество и достаточное количество. Хорошая экстракция позволит точно определить гаплоидные копии генома за реакцию. По нашему опыту, коммерчески доступный набор (см. Таблицу материалов)обеспечивал неизменно высокое качество извлечения ДНК. Тем не менее, извлечение отдельных комаров может оказаться особенно сложным, поскольку гранулу ДНК становится трудно визуализировать и ее можно легко всасывать с супернатантом, если не осторожно. Во-вторых, грунтовки и зонды должны быть тщательно спроектированы. Перед завершением эксперимента ddPCR убедитесь, что разработанные праймеры приводят к одному продукту ПЦР, сначала выполняя традиционную ПЦР и визуализируя один продукт с помощью гелевого электрофореза. Эталонный зонд FAM также должен быть спроектирован таким образом, чтобы он дополнял высококонсервативную последовательность. Это обеспечит точное обнаружение аллелей WT в разнообразной популяции. Комбинации грунтовки и зонда для каждого уникального эксперимента будут иметь различные условия термоциклера, и рекомендуется оптимизировать эти условия с использованием теплового градиента.
Существуют и другие методы идентификации инделей, такие как секвенирование Сэнгера или NGS. Секвенирование Сэнгера ограничено, потому что оно имеет нижний предел обнаружения и низкую способность обнаружения для идентификации новых вариантов. Секвенирование Сэнгера также является трудоемким и не является высокопроизводительным. По сравнению с секвенированием Сэнгера, NGS не имеет таких же ограничений низкой чувствительности, мощности обнаружения и пропускной способности. Еще одним преимуществом NGS является его способность обнаруживать различные мутации от однонуклеотидного полиморфизма (SNP) до перегруппировок. Тем не менее, NGS является более дорогостоящим и трудоемким методом в применении определения Cas9 / gRNA-ассоциированных инделей, поскольку существует только одна целевая область, представляющая интерес, и она лучше всего подходит для более крупных анализов генома. По сравнению с вышеупомянутыми методами, ddPCR обладает высокой пропускной способностью и быстрым временем обработки. Если материалы и инструменты ddPCR доступны собственными силами, 96 образцов могут быть обработаны в течение 1-2 дней, что делает его хорошо подходящим для быстрого анализа крупных испытаний Cas9/gRNA-модифицированных организмов.
Хотя для ddPCR существует много преимуществ, существуют и ограничения. Во-первых, оборудование ddPCR не часто доступно в независимой лабораторной среде. Оборудование ddPCR может быть доступно совместно в более крупных научно-исследовательских учреждениях, но это не позволяет легко генерировать и анализировать данные за пределами учреждения. Во-вторых, в отличие от альтернатив, ddPCR не предоставляет отдельных уникальных последовательностей идентифицированных индел-мутаций. Цифровая капельная ПЦР обеспечит частоту мутаций инделя в популяции, но без последовательности невозможно определить, являются ли присутствующие индели более склонными сохранять или ингибировать функцию интересующего гена. Метод ddPCR, возможно, лучше всего подходит для анализа диких популяций после полевого испытания приводного организма на основе Cas9 / gRNA, поскольку он может эффективно определять частоту внедрения трансгена в местную популяцию и генерации инделов в популяции в режиме, близком к реальному времени. Благодаря быстрому времени обработки ddPCR было бы целесообразно еженедельно проводить отбор проб и анализ популяции в регионе полевых испытаний, если бы материалы были доступны на местном уровне. Начальные затраты на покупку, импорт и установку оборудования ddPCR будут высокими в удаленных лабораториях, но преимущества возможности строгой оценки дикой популяции, поскольку она подвергается модификации из системы привода, оправдают затраты.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование было предоставлено Инициативой по борьбе с малярией в Ирвине Калифорнийского университета. AAJ является профессором Дональда Брена в Калифорнийском университете в Ирвине.
Materials
| Reagents | |||
| ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
| Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
| Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
| Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| Materials | |||
| ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
| Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Equipment | |||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |
Referências
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).
- Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Boëte, C. Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control. EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).
- Carballar-Lejarazú, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Wang, Z., et al. Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902 (2019).
- Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection. Scientific Reports. 8 (1), 9650 (2018).
- Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing. BMC Genomics. 15 (1), 1002 (2014).
- Carballar-Lejarazú, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi. Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).
- Holt, R. A., et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298 (5591), 129-149 (2002).
