Atividade da Linha Lateral Posterior Neurônios Diferentes durante a Natação em Zebrafish

Diferentes neurônios de sistemas de mecanosensoria transmitem informações das células ciliares para o cérebro durante a audição e equilíbrio. A eletrofisiologia pode revelar a sensibilidade de neurônios diferentes através de gravações diretas. Embora a remenda celular inteira das células ciliares possa ser desafiadora, o registro a partir de neurônios a montante é mais fácil e permite a avaliação dos potenciais de ação em resposta às estimulações controladas^1,2,3. Estimular as células ciliadas leva à sua deflexão, o que modifica estruturas mecanosensoriais, desencadeando assim um aumento nos potenciais de ação (picos) em neurônios diferentes^4,5,6. Na ausência de estímulos externos, os neurônios aferentes também aumentam espontaneamente devido ao vazamento de glutamato das células ciliadas nos diferentes terminais pós-sinápticos^7,8, e têm se mostrado contribuintes para a manutenção da sensibilidade^9,10. O registro do grampo de correção da atividade aferente permite a observação da sensibilidade das células ciliares e da dinâmica do sinal que não são possíveis utilizando técnicas com menor resolução temporal, como na microfônica^11,12 ou imagem funcional de cálcio^13,14,15. O protocolo a seguir permitirá o registro de atividades diferentes concomitantemente com comandos motores para revelar alterações instantâneas na sensibilidade das células ciliares.

Os zebrafish (Danio rerio) utilizam células ciliares contidas em neuromasses que compõem o sistema de linha lateral para detectar o movimento da água em relação ao seu corpo, o que é traduzido em sinais neurais essenciais para a navegação^16,17,18, prevenção de predadores, captura de presas^19,20, e escolaridade²¹. O fluxo de água também pode ser autogerado pelos movimentos da natação^22,23,24, respiração^22,25,26e alimentação²⁷. Esses comportamentos compreendem movimentos repetitivos que podem fadigar as células ciliares e prejudicar a detecção. Portanto, é fundamental que o sistema de linha lateral diferencie entre estímulos de fluxo externos (exafentes) e autogerado (reafeto). Uma descarga corolária atenua sinais de fluxo autogerados durante a locomoção em zebrafish. Este sinal motor preditivo inibidor é retransmitido através de neurônios descendentes para os receptores sensoriais para modificar a entrada ou interromper o processamento do feedback reafesso^28,29. O trabalho seminal que contribuiu para a nossa compreensão inicial deste sistema de alimentação contou com preparações in vitro onde a conectividade e a atividade endógena do circuito neural não foram mantidas^{28,30,31,32,33,34,35}. Este protocolo descreve uma abordagem para preservar um circuito neural intacto onde a dinâmica de feedback endógeno é mantida, permitindo assim uma melhor compreensão da descarga corolária in vivo.

O protocolo aqui descrito descreve como monitorar a linha lateral posterior a atividade de neurônios e neurônios motores simultaneamente em zebrafish larval. Caracterizar uma dinâmica de sinal diferente antes, durante e depois dos comandos motores, fornece insights sobre o feedback endógeno em tempo real do sistema nervoso central que modula a sensibilidade das células ciliares durante a locomoção. Este protocolo descreve quais materiais precisarão ser preparados antes dos experimentos e, em seguida, descreve como paralisar e preparar larvas de zebrafish. O protocolo descreverá como estabelecer uma gravação de remendo solto estável de neurônios aferentes e gravações de raiz ventral extracelular (VR) de neurônios motores. Os dados representativos que podem ser obtidos por meio deste protocolo são apresentados a partir de um indivíduo exemplar e a análise foi realizada em múltiplas réplicas do protocolo experimental. O pré-processamento de dados é realizado usando scripts escritos personalizados no MATLAB. No geral, esse paradigma experimental in vivo está pronto para proporcionar uma melhor compreensão do feedback sensorial durante a locomoção em um modelo de sistema de células ciliadas vertebradas.

Todos os cuidados e experimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Flórida.

1. Preparação de materiais para gravações eletrofisiológicas

1. Faça um prato de gravação com fundo de elastômero de silicone.
   1. Distribua uma fina camada de componentes de elastômero de silicone auto-misturados (por exemplo, Sylgard) em um prato de cultura de tecido com fundo de vidro até que ele se níveis com a borda do poço raso. Aproximadamente 0,5 mL é suficiente.
   2. Cubra e cure o prato por um mínimo de 48 h em temperatura ambiente.
2. Faça alfinetes de dissecção.
   1. Forneça uma carga negativa (5 V) a um béquer de 100 mL de etchant (3M KOH) usando uma fonte de alimentação DC e conecte um fio de tungstênio (0,002 polegadas; 50,8 μm de diâmetro) à saída carregada positivamente.
      ATENÇÃO: Os fios negativos e positivos não devem entrar em contato entre si durante este procedimento, pois você pode correr o risco de produzir faíscas, o que pode representar um potencial risco de incêndio.
   2. Etch tungstênio fio por rápida e repetidamente mergulhando a ponta do fio no banho etchant até que a ponta se estreita para um ponto afiado. Sob um estereótipo, corte o fio aproximadamente 1 mm da ponta com uma lâmina de barbear de borda reta. Repita mais três vezes e, em seguida, insira pinos no prato de gravação curado usando fórceps finos.
3. Prepare eletrodos de gravação.
   1. Puxe um tubo capilar de vidro borossilicacate (diâmetro interno: 0,86 mm, diâmetro externo: 1,50 mm) utilizando um puxador de micropipette horizontal com filamento de caixa em eletrodos com uma ponta de diâmetro de 30 μm com ligeira fita(Figura 1 Ai) que será usada para registrar neurônios diferentes da linha lateral posterior.
   2. Puxe um tubo capilar de vidro borossilicato adicional em um par de eletrodos com diâmetros de ponta menores (1-5 μm). Segurando um eletrodo em cada mão, execute delicadamente as pontas umas sobre as outras para quebrá-las em um ângulo de ~30°. Com um microforge, polir a ponta chanfrada até ficar homogêneo. O diâmetro da ponta final deve ser entre 30-50 μm e será usado como eletrodo de gravação da raiz ventral (VR)(Figura 1 Aii).
   3. Marque o lado do eletrodo VR com a borda superior com tinta permanente para ajudar a orientar a abertura da ponta para baixo ao inserir o eletrodo no suporte da pipeta do headstage (passo 3.2).
      NOTA: A modificação mecânica do eletrodo de gravação vr é imprecisa e a etapa 1.3.2 pode exigir múltiplas tentativas até que uma morfologia de ponta adequada seja alcançada antes do polimento. O eletrodo de gravação vr é chanfrado para se adequar à curva corporal das larvas. Uma vez fabricado, o eletrodo de gravação VR pode ser usado repetidamente, desde que a ponta permaneça clara e limpa entre os experimentos.
4. Gere o protocolo em programas de gravação de eletrofisiologia.
   1. Certifique-se de que o headstage direito esteja conectado à entrada do Canal 1 na parte de trás da corrente de microeletrodo e do amplificador de tensão para as gravações de neurônios aferentes e o headstage esquerdo está conectado à entrada do Canal 2 para as gravações vr.
      NOTA: As especificações do computador para o amplificador de grampo de corrente e tensão requerem minimamente 1 Ghz ou um processador melhor, Windows XP Pro ou Mac OS X 10.46.6, unidade CD-ROM com 512 MB de RAM, espaço de disco rígido de 500 MB e 2 portas USB.
   2. Abra o software do amplificador controlado pelo computador.
   3. Defina o Canal 1 e o Canal 2 para o modo de fixação atual clicando no botão IC para cada canal.
   4. Insira os seguintes parâmetros nas guias I-Clamp 1 e I-Clamp 2 . Saída Primária: 100x Potencial de membrana CA (100.000 mV/mV), Ganho: 1.000, Bessel: 1 kHz , AC: 300 Hz , Escopo: Bypass . Saída secundária: 100x Potencial de membrana AC (100 mV/mV) , Ganho: 1 , Filtro Lowpass: 10 Hz.
   5. Salve parâmetros de canal como Ch1_Aff e Ch2_VR.
   6. Instale e abra o software de eletrofisiologia do grampo de remendo.
   7. Clique em Configurar e selecione Lab Bench para configurar os sinais analógicos adicionando Ch1_Aff e Ch2_Vr aos canais digitador (por exemplo, analogia in #0 e #1 Analógico IN) que estão conectados, por cabo coaxial BNC, às saídas dimensionadas correspondentes do Canal 1 e do Canal 2 do amplificador. Clique em OK.
      NOTA: Os requisitos mínimos do computador para o digitalizador são: um processador de 1 Ghz ou melhor, Windows XP Pro ou Mac OS X 10.46.6, unidade CD-ROM de 512 MB de RAM, espaço de disco rígido de 500 MB e 2 portas USB.
   8. Clique em Adquirir e selecione Novo Protocolo.
   9. Na guia Modo/Taxa, selecione Gap Free; em Modo de Aquisição, defina o Comprimento de Ensaio para usar o espaço disponível em disco (ou seja, gravar até parar) ou um conjunto desejado Duração (hh:mm:ss),e, em seguida, definir a taxa de amostragem por sinal (Hz) para 20.000 para maximizar a resolução.
   10. Na guia Entradas, selecione os canais Analógicos IN configurados anteriormente (na etapa 1.4.6) e selecione Ch1_Aff e Ch2_VR para o canal correspondente.
   11. Na guia Saídas, selecione Cmd 0 e Cmd 1 para #0 de Canal e #1 do Canal,respectivamente.
       1. Conecte o comando do Canal 1 no amplificador ao Analógico Ouput 0 no digitalizador via cabo coaxial BNC e repita para o Comando do Canal 2 para a Saída Analógica 1.
   12. As guias restantes podem permanecer em configurações padrão. Clique em OK e salve o protocolo.

2. Preparação da solução

1. Prepare a solução de Hank: 137 mM NaCL, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na₂HPO₄, 0,44 mM KH₂PO₄, 1,3 mM CaCl₂, 1,0 mM MgSO₄, 4,2 mM NaHCO₄; pH 7.3. Diluir para 10% a solução de Hank adicionando o volume apropriado de água deionizada ao estoque.
2. Prepare a solução extracelular: 134 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,2 mM MgCl₂, 2,1 mM CaCl_2,10 mM de glicose, 10 mM tampão HEPES; pH 7.8 ajustado com NaOH. Solução extracelular do filtro de vácuo através do filtro com tamanho de poro de 0,22 μm.
3. Prepare α -bungarotoxina: Dissolva 1 mg de α-bungarotoxina liofilizada em solução extracelular de 10 mL para produzir diluição de 0,1%.
4. Prepare a solução de eutanásia: 50% (mg/L) de grau farmacêutico tamponado MS-222 em 10% da solução de Hank.
   ATENÇÃO: α-bungarotoxina é uma neurotoxina potente que paralisa os músculos bloqueando receptores colinérgicos. Luvas são necessárias e a proteção ocular é recomendada durante o manuseio do paralítico.

3. Preparação de larvas para gravações eletrofisiológicas

1. Imobilize larvas de zebrafish.
   1. Use larvas da população de zebrafish(Danio rerio; 4-7 dias após a fertilização) e casa em solução de embrião (solução de 10% Hank) a 27 °C.
   2. Transfira larvas da carcaça para uma pequena placa de Petri (35 mm) usando uma pipeta de transferência de ponta grande e remova o máximo possível da solução circundante.
      NOTA: A remoção da solução embrionária previne a diluição do paralítico e aumenta sua eficácia. O canto de uma limpeza de tarefas pode ser usado para afastar a solução restante do embrião, e é fundamental não entrar em contato com as larvas ou deixar larvas expostas ao ar.
   3. Mergulhe larvas em 10 μL de 0,1% α-bungarotoxina por aproximadamente 5 min.
      NOTA: O tempo necessário para imobilizar larvas varia entre as preparações. Uma preparação saudável depende do monitoramento de perto do fluxo sanguíneo rápido sustentado e da diminuição das respostas motoras. Uma breve superexposição ao paralítico pode levar a um declínio lento na saúde geral da preparação, mesmo após uma lavagem completa. É melhor aplicar uma lavagem antes que a larva seja completamente imobilizada enquanto ainda mostra sinais de vibrações musculares sutis.
   4. Lave a larva paralisada com solução extracelular e tome banho por 10 minutos.
      NOTA: A lavagem permite que a larva transite de vibrações musculares sutis para paralisia completa. Além disso, α-bungarotoxina é um antagonista do receptor de acetilcolina nicotínica (nAChR) α9-subunit, que é um componente crítico do circuito de feedback endógeno que este protocolo observa; no entanto, esse efeito tem se mostrado reversível nas células ciliar xenopus e zebrafish após uma lavagem de 10 minutos^36,29.
2. Pino peixe no prato de gravação.
   NOTA: A anestesia (por exemplo, MS-222, Tricaine) não é necessária durante o preparo de zebrafish larval (4-7 dpf) pois interfere na saúde animal. Na verdade, os zebrafish larval estão isentos de certos protocolos vertebrados.
   1. Usando pipeta de transferência, mova a larva do banho de solução extracelular para o prato de gravação com fundo de silicone. Encha o restante do prato com solução extracelular.
   2. Sob um estereótipo, posicione suavemente as larvas com fórceps finos acima do centro do tapete de silicone, lateral para cima, com as extremidades anterior e posterior do corpo correndo da esquerda para a direita, respectivamente. Em seguida, segure um pino gravado do tapete de silicone usando fórceps finos e insira o pino, ortogonalmente ao silicone, através do notochord dorsal das larvas diretamente dorsal para o ânus. Insira o segundo pino através do notochord perto da extremidade da cauda e insira o terceiro pino através do notochord dorsal da bexiga gasosa(Figura 1B).
      NOTA: Ao inserir pinos, é importante atingir o centro da largura notochord para evitar o fluxo sanguíneo ou danificar a musculatura circundante. O notochord é dorsal para o nervo da linha lateral posterior, por isso, com a fixação adequada, não se espera danos aos neurônios sensoriais da linha lateral. Insira após o primeiro contato para não perturbar o tecido circundante. Idealmente, o diâmetro do pino é menos da metade da largura do notochord para garantir a inserção limpa. Se os pinos excederem essa largura, repita o passo 1.2 até que a largura do pino desejada seja atingida. Se o fluxo sanguíneo diminuir após a fixação, repita a partir do passo 1.3 em diante com um novo espécime.
   3. Insira o quarto pino através da vesícula otica, proporcionando uma leve rotação em direção ao anterior à medida que o pino se insere no encapsulante(Figura 1B). À medida que uma leve rotação é aplicada, observe o tecido entre o cleithrum e o vesícula otic para revelar o aglomerado de somata aferente.
      NOTA: A inserção em ângulo do quarto pino é para garantir a exposição da linha lateral posterior um gânglio diferente, que é obstruído pela grande vesícula otica.

4. Gravação de raiz ventral

1. Coloque a larva presa sob o objetivo de imersão de água de 10x em um microscópio de interferência diferencial de palco fixo (DIC) e oriente as fissuras myseptal dos blocos musculares paralelamente ao vetor de aproximação da cabeça esquerda(Figura 1B).
   1. Um microscópio DIC de estágio fixo flutuado em uma mesa de ar óptica funciona melhor para evitar que vibrações interfiram com as gravações. Usando um posicionador motorizado, o microscópio pode então mover-se livremente ao redor do estágio fixo no qual a preparação e os headstages são montados(Figura 1C).
   2. Coloque o fio moído na solução do banho e certifique-se de que ele esteja conectado ao palco esquerdo.
2. Encha o eletrodo de gravação VR com 30 μL de solução extracelular usando uma ponta flexível de pipeta de carregamento de gel e insira no suporte de pipeta da cabeça esquerda.
3. Abaixe a pipeta de gravação na solução de prato com um micromanipulador enquanto aplica pressão positiva (1-2 mmHg) produzida por um transdutor pneumático. Sob ampliação de 10x, confirme se a orientação da abertura da ponta está voltada para baixo.
   1. O transdutor pneumático deve ser conectado à porta do porta-tubulação por tubulação de silicone.
4. Coloque o eletrodo VR no myoseptum
   1. Usando o micromanipulador novamente, abaixe a ponta do eletrodo VR até que esteja mantendo a posição acima da larva. Aumente a ampliação para imersão de 40x.
   2. Leve a ponta do eletrodo sobre um myoseptum entre dois myomeres ventral para a linha lateral até que a fissura esteja centrada na abertura da ponta do eletrodo VR(Figura 1D).
   3. Abaixe a pipeta até que a borda defasada da abertura da ponta entre em contato suavemente com o epitélio. Após o contato inicial, manobre a pipeta na diagonal para garantir que a borda principal faça contato e possa gerar uma vedação.
   4. Aplique pressão negativa (~100 mm Hg) com o transdutor pneumático e segure.
      NOTA: A orientação adequada da pipeta VR em relação ao mioseptum e à pressão negativa contínua otimiza a detecção da atividade do neurônio motor com uma alta relação sinal-ruído através da pele.
5. Detecte a atividade do neurônio motor.
   1. O headstage esquerdo deve ser conectado ao amplificador, que retransmite o sinal amplificado em um digitalizador que produz o referido sinal para o software de eletrofisiologia do grampo de remendo a ser monitorado em um computador adjacente (ver seção 1.4).
   2. No software de grampo de correção, clique no botão Reproduzir na barra de ferramentas para monitorar o sinal VR (Figura 1E).
   3. Certifique-se de que a gravação vr está sendo alcançada uma vez que a atividade do neurônio motor com dinâmica bem estereotipado do sinal de explosão é observada^29,37 (Figura 1E).
      NOTA: As crises de natação fictícias são os padrões de atividade dos neurônios motores VR que continuam a transmitir apesar da preparação estar paralisada. Portanto, os natações fictícias são um meio acessível de determinar o estado comportamental do animal e medir parâmetros locomotores ao mesmo tempo em que realizam gravações de neurônios diferentes que requerem uma preparação imobilizada. Em nossas mãos, uma vez que uma gravação vr é alcançada, uma preparação saudável provocará lutas voluntárias de natação fictícia a cada poucos segundos. Lembre-se, uma preparação saudável tem sustentado o fluxo sanguíneo rápido. Esteja avisado, a obtenção de um sinal VR suficiente pode levar vários minutos e a relação sinal-ruído pode melhorar após a detecção inicial. No interesse do tempo, é aceitável passar para a seção 5.
   4. Se uma gravação vr ainda não for alcançada após completar a seção 5, solte a pressão negativa, levante o eletrodo e repita a partir da etapa 4.4.2 em diante em um myoseptum diferente se a saúde da larva ainda estiver ótima.

5. Gravação de neurônios diferentes

1. Encha o eletrodo de gravação aferente com 30 μL de solução extracelular; inserir no suporte de pipeta do palco direito(Figura 1B,C), e inferior à solução de prato, aplicando pressão positiva (1-2 mm Hg) produzida por um transdutor pneumático.
2. Localizar e fixar-se vagamente à linha lateral posterior um gânglio diferente.
   1. Usando um micromanipulador, abaixe a ponta de eletrodo diferente até que esteja mantendo posição acima do cleithrum.
   2. Aumente a ampliação para imersão de 40x e localize a intersecção do nervo da linha lateral posterior e cleithrum. Siga o nervo da linha lateral anterior do cleithrum até onde as fibras inervam a linha lateral posterior afferent gânglio, distinguido pelo discreto aglomerado de soma(Figura 1F).
   3. Leve a ponta do eletrodo sobre o gânglio aferente e baixe a pipeta até que a ponta entre em contato com o epitélio. Suavemente, manobre o eletrodo para que toda a circunferência da ponta entre em contato com o gânglio aferente.
   4. Aplique pressão negativa (20-50 mm Hg) com o transdutor pneumático e segure.
      NOTA: A pressão negativa aplicada ao gânglio aferente é mais suave do que a sucção aplicada durante a gravação da raiz ventral. O aumento da pressão negativa pode melhorar o sinal-ruído, mas a saúde dos neurônios diminui sob sucção agressiva sustentada, o que diminui a probabilidade de um registro bem-sucedido.
3. Registrar uma atividade de neurônio diferente.
   1. Certifique-se de que o headstage direito esteja conectado em uma sequência semelhante à descrita na etapa 4.5.1.
   2. Em pClamp10, clique no botão Reproduzir na barra de ferramentas para monitorar neurônios e sinais VR diferentes simultaneamente.
   3. Certifique-se de que toda a célula, a gravação de remendos soltos de neurônios diferentes é alcançada uma vez que os picos ocorrem espontaneamente, aproximadamente a cada 100-200 ms^1,29 (Figura 1E).
   4. Gradualmente, aumente a pressão de eletrodo de gravação de neurônios aferentes de volta para atmosférico (0 mm Hg) e segure para o restante da gravação.

6. Aquisição de dados

1. Gravação simultânea.
   1. Uma vez detectada a atividade de neurônios e neurônios motores, clique no botão Gravar na barra de ferramentas em pClamp10 para capturar gravações simultâneas livres de lacunas em ambos os canais.
   2. Registro para a duração desejada(Figura 1E).
      NOTA: Uma gravação em uma preparação saudável pode durar muitas horas e permanecer respondendo a estímulos externos.
   3. Salve a gravação como um tipo de arquivo suportado (.abf, pClamp10) para preservar metadados, como parâmetros de aquisição.

7. Eutanásia

1. Aplique pressão positiva (10 mm Hg) tanto para os eletrodos de gravação aferentes quanto vr usando transdutores pneumáticos e levante os eletrodos da placa de gravação usando os micromanipuladores.
2. Transfira o prato de gravação do microscópio DIC de estágio fixo para o estereóscópio de dissecção.
3. Usando fórceps finos, remova os pinos de tungstênio da cápsula notochord e otic, e transfira as larvas usando uma pipeta de transferência para uma placa de Petri (35 mm) contendo 5 mL de solução de eutanásia por um mínimo de 5 min.

8. Pré-processamento e análise de dados

NOTA: O pré-processamento e a análise de dados exigirão uma compreensão básica da codificação da linha de comando.

1. Converta o arquivo de gravação para pré-processamento.
   1. Instale o software Matlab.
   2. Baixe o script escrito personalizado, abfload.m³⁸ e salve o arquivo na mesma pasta que armazena o arquivo de gravação bruto.
   3. Na janela Do Editor do Matlab, abra abfload.m e clique em Executar na barra de ferramentas. Selecione A pasta de alteração, se solicitado.
   4. Execute a função na janela de comando com o arquivo de gravação bruto como a entrada,
      > [d,si,h] = abfload('[nome do arquivo de gravação bruto].abf')
      e salvar o espaço de trabalho de saída com um nome de arquivo que inclui designação de larva, idade e data experimental, como [número de amostra]_[idade em dpf]_[nome do arquivo de gravação bruta (inclui data experimental por padrão)].
      NOTA: O nome do arquivo convertido deve incluir apenas inteiros delineados.
2. Realize o pré-processamento de dados.
   1. Baixe o script matlab AffVR_preprocess.m e funções associadas, escritas sob medida pelos autores.
   2. Na janela do editor, abra AffVR_preprocess.m.
   3. Em Variáveis,ajuste limiares de detecção de picos de borda inferior para gravações aferentes e vr(spk_detect_lb e vr_detect_lb, linhas 8 e 14, respectivamente) dependendo da gravação da relação sinal-ruído.
      NOTA: A detecção de picos depende de limiares manuais para classificar e isolar sinais de mais de um neurônio aferente por amplitude. O ruído e a atividade da linha de base de outras unidades são filtrados por limiares para incluir apenas amplitudes de pico dentro de uma porcentagem (por exemplo, spk_detect_lb) do máximo (por exemplo, spk_detect_ub). O limiar também garante o binning preciso dos picos de atividade motora em rajadas e lutas coletivas de natação fictícia. Geralmente, comece com um limite inferior de 0,5, e diminua gradualmente até que a detecção precisa seja alcançada. Por exemplo, a fixação spk_detect_lb como 0,5 e spk_detect_ub como 1.0 detectará todos os picos iguais ou superiores a 50% da amplitude de pico máximo e excluirá ruídos ou neurônios adicionais de amplitudes de picos mais baixos(Figura 2A). Alternativamente, também pode-se reduzir o spk_detect_ub de 1,0 para excluir neurônios de amplitudes de pico mais altas, a fim de isolar os neurônios de amplitudes de pico mais baixas. As saídas de números de pré-processamento (ver etapa 7.2.6) informarão se ajustes e repetições da etapa 7.2.2 são necessários.
   4. Na janela Editor, clique em Executar para executar AffVR_preprocess.m.
   5. Navegue até o arquivo de dados .mat convertido anteriormente (ver etapa 7.1.3); selecionar e clicar em Abrir para iniciar o pré-processamento automatizado.
      NOTA: Enquanto o script personalizado estiver sendo executado, as saídas aparecerão na janela de comando informando seu progresso através de etapas de processamento como "filtragem de dados...", "detectando atividade raiz ventral..." e "gerar figuras...".
   6. Os números gerados pelo AffVR_preprocess.m visualizarão a detecção de picos e VR diferentes e indicarão se quaisquer variáveis de análise devem ser ajustadas(Figura 2).
   7. Digite "Y" no teclado para salvar metadados pré-processados em uma pasta preprocess_output.
   8. Os dados pré-processados serão automaticamente produzidos à medida que data_out.xls.
3. Analise os dados pré-processados conforme desejado.

Depois que as larvas de zebrafish são devidamente imobilizadas e a linha lateral posterior é alcançada, a atividade em neurônios aferentes e motores pode ser medida simultaneamente. Os canais de gravação são exibidos usando protocolos de gravação livres de lacunas (etapa 1.4) para monitoramento contínuo de atividades aferentes e vr. Em tempo real, podem ser observadas reduções na taxa de pico espontâneo efervescente, concomitantemente com atividade vr indicativa de natação fictícia(Figura 1E). Descobrimos que os melhores resultados e a detecção precisa de picos foram produtos de gravações que alcançaram uma relação sinal-ruído de pelo menos 0,5. Scripts de pré-processamento personalizados gerados gráficos para ajudar na visualização da detecção de picos aferentes e vr. Picos aferentes espontâneos são identificados utilizando-se uma combinação de parâmetros de pico, como limiar, duração mínima (0,01 ms) e intervalo mínimo entre picos (ISI; 1 ms). O aumento da pressão negativa ao estabelecer a gravação muitas vezes produz detecção de sinal de várias unidades diferentes ao mesmo tempo. Filtrar por amplitude permite distinguir entre dinâmicas de sinal de aferentes independentes. Sinais isolantes podem ser obtidos ajustando as variáveis de detecção de limites inferiores e superiores no script de pré-processamento(Figura 2A). Sucção agressiva para alcançar gravações multi-unidades pode levar a gravações instáveis, ruído mecânico, degradação de uma saúde diferente e, finalmente, uma perda de sinal. Portanto, é importante discar lentamente a sucção para trás para a pressão atmosférica uma vez que o sinal desejado é alcançado. A detecção de picos radiculares ventral segue parâmetros idênticos à detecção de picos diferentes, mas requer entradas adicionais para definir ataques de natação fictícios distintos. As rajadas dentro de um comando motor são definidas pela atividade VR com um mínimo de dois picos dentro de 0,1 ms um do outro e duraram um mínimo de 5 ms. Todas as lutas de natação são então delineadas por um mínimo de três rajadas com intervalos entre rajadas de <200 ms(Figura 2B).

Uma atividade diferente é difícil de interpretar quando se olha para uma gravação em sua totalidade. Os scripts de pré-processamento sobreporão seções de atividades diferentes centradas em um período de interesse bem definido, neste caso, o início de um ataque de natação (n = 33, Figura 2C) para auxiliar na visualização de tendências na dinâmica do sinal. A atividade aferente instantânea é calculada usando um filtro de média móvel e uma janela de amostragem de 100 ms. A atividade espontânea média mostra mudanças dramáticas em resposta ao início da atividade motora (Figura 2C). Para melhor dissecar e analisar a atividade diferente, períodos antes e depois da natação são definidos para coincidir com o intervalo de tempo da luta de natação correspondente. No roteiro de pré-processamento e os resultados analisados pelo representante, esses períodos são denominados "pré-nado" e "pós-natação". As taxas de pico de pré-natação, natação e pós-natação foram calculadas tomando o número de picos no respectivo período ao longo de sua duração. A precisão das estimativas para cada indivíduo é em parte uma função do número de natações, por isso analisamos as relações variáveis utilizando regressões ponderadas, com pesos individuais iguais à raiz quadrada do número de natações.

As diferenças nas taxas de pico diferentes ao longo dos vários períodos de interesse (pré-natação, natação e pós-natação) foram testadas por uma análise bidirecional de variância (ANOVA). O teste pós-hoc de Tukey detectou diferenças significativas nas taxas de pico entre as taxas de pico de natação e as taxas de pico de ambos os pré-nados (8,94 ± 0,2 Hz, redução relativa de 57%) e pós-natação (5,34 ± 0,2 Hz, redução relativa de 40%) regras. A taxa de pico não retornou imediatamente à linha de base, dado que também descobrimos que a taxa de pico pós-natação foi menor do que a taxa de pico pré-natação (testes pós-hoc de Tukey entre grupos, p < 0,001; Figura 3A). Modelos lineares foram utilizados para detectar relações entre a taxa de pico relativo e os parâmetros de natação fictícia. A taxa de pico relativo foi calculada tomando a taxa de pico de natação sobre a taxa de pico pré-natação. Os parâmetros fictícios de natação incluíram duração de natação, frequência de natação (ou seja, número de rajadas dentro de uma luta de natação durante a duração da natação) e ciclo de trabalho (ou seja, soma das durações de natação sobre a duração total da luta de natação). Em nossas mãos, a média e a variância da taxa de pico relativo estavam correlacionadas, por isso era necessário que os dados fossem transformados para análise. A taxa de pico aferente foi negativamente correlacionada com a duração da natação, o que significa que a linha lateral experimenta maior inibição durante natações de maior duração (r² = 0,186, F_2,26 = 2,971, p = 0,045; Figura 3B). Não foi detectada correlação entre a taxa de pico relativo e nem a frequência de natação nem o ciclo de serviço ((r² = 0,099, F_2,26 = 1,431, p = 0,231 e r² = 0,047, F_2,26 = 0,645, p = 0,932, respectivamente; Figura 3C,D). Todas as análises das relações variáveis foram ponderadas pelo número de natações por indivíduo e todas as variáveis foram então mediadas por cada indivíduo (n = 29).

Figura 1: Registro eletrofisiológico simultâneo da linha lateral posterior aferente neurônio e atividade da raiz motor ventral. (A). Exemplo de um patch aferente(i)e raiz do motor ventral(ii)gravando eletrodos. As barras de escala representam 50 μm. (B) Os zebrafish larval estão paralisados e fixados em quatro locais (símbolos cruzados) a um prato Sylgard para estabilidade de registro. Cruzes arrojadas representam pontos de inserção para pinos. (C) A plataforma de eletrofisiologia é montada em uma mesa de isolamento de vibração e consiste em um microscópio de estágio fixo vertical em um controlador motorizado capaz de ampliação de 40x. Os estágios da cabeça do grampo de corrente dupla e da tensão são montados em micromanipuladores. (D) Os mirômeros da musculatura corporal são separados pela miosepta que servem como marcos de registro para arborizações de neurônios motores. O eletrodo da raiz do motor ventral se aproxima do corpo ventral (à esquerda) e é centrado e abaixado em cima de um mioseptum (ponta de flecha). Barra de escala representa 50 μm. (E) Captura de tela de gravação eletrofisiológica em tempo real permitindo visualização da atividade aferente espontânea (canal 1) e estouro da atividade raiz ventral indicativa de luta de natação fictícia (canal 2). Os botões Record e Play são denotados com setas vermelhas. (F) A linha lateral posterior de diferentes gânglios (linha tracejada) fica logo abaixo da pele e pode ser identificada por um aglomerado apertado de soma diferente. O gânglio pode ser localizado seguindo o nervo da linha lateral após o osso cleithrum (ponta de flecha) até onde ele se conecta ao gânglio. A barra de escala representa 30 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Saídas de figura de pré-processamento visualizam detecção precisa de picos. (A) Extracelular, gravação de patch solto de neurônios laterais posteriores de linha lateral. Picos discretos (rotulados com pontos vermelhos) são detectados com um intervalo mínimo entre picos de 1 ms. O ruído e a atividade da linha de base de outras unidades são filtrados por limiares para incluir apenas amplitudes de pico dentro de 50% do máximo. (B) Gravação de raiz do motor ventral (VR) de natação fictícia revelam comandos motores voluntários durante toda a duração da gravação. Os picos vr (pontos vermelhos) são detectados usando um filtro de limiar semelhante e, em seguida, binned em um único ataque de natação (verde) detectando uma explosão de atividade dentro de 200 ms um do outro (ver inserir; barra de escala representa 200 ms). Os picos detectados fora da luta de natação definida não ocorrem dentro do intervalo de espetos da atividade de explosão estereotipada e, portanto, são excluídos. (C) Média de picos espontâneos efervescentes centrado no início de cada luta de natação (tempo = 0 s) ilustrando a taxa de pico antes, durante e depois da natação. As barras de erro representam ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Quantificação da atividade aferente antes, durante e depois da natação fictícia. (A) A taxa de pico aferente é significativamente reduzida durante a natação e esse efeito persiste mesmo depois. Agrupamentos estatisticamente semelhantes são denotados por a e b. (B) A maior duração da natação está correlacionada com a diminuição da taxa de pico. (C-D) A frequência de natação e o ciclo de serviço de natação não mostram correlação com a taxa de pico diferente. Todos os valores representam ± SEM. Indivíduos com baixo peso estatístico foram omitidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O protocolo experimental descrito fornece o potencial para monitorar mudanças endógenas na entrada sensorial através de comportamentos motores em um vertebrado intacto e comportado. Especificamente, ele detalha uma abordagem in vivo para realizar gravações extracelulares simultâneas de neurônios de linha lateral e raízes motoras ventrais em zebrafish larval. A atividade aferente espontânea tem sido previamente caracterizada em zebrafish sem considerar a potencial atividade motor simultânea^1,2,39,40,41. Sem monitorar a presença de atividade motora com gravações de raiz ventral, decifrar atividades diferentes provavelmente será subestimada devido à influência da inibição eferente durante, e mesmo depois, natação espontânea.

Gravações eletrofisiológicas in vivo são inerentemente desafiadoras. Em nossa experiência, manter uma preparação saudável é o maior fator para alcançar gravações bem sucedidas e duradouras para neurônios diferentes e raízes motoras ventrais. Para isso, é importante não apenas identificar e monitorar o fluxo sanguíneo rápido, mas também reconhecer a textura da pele e a musculatura subjacente. Recomendamos observar várias larvas paralisadas sob um microscópio antes de manusear ainda mais para se familiarizar com o fluxo sanguíneo intrínseco e o estado da pele de larvas saudáveis. Uma gravação de raiz ventral bem sucedida através da pele requer uma superfície de pele lisa e saudável para que o eletrodo de gravação gere uma vedação apertada. Essa abordagem contorna os protocolos tradicionais^37,42 que são invasivos e demorados, que exigem dissecar o epitélio para expor a musculatura subjacente. Um inconveniente de gravar através da pele é a variabilidade potencial no tempo antes que os sinais sejam realizados. Otimizar a magnitude e a duração da pressão negativa aplicada diminuirá o tempo necessário para estabelecer um sinal e potencialmente melhorará a relação sinal-ruído. Gravações de uma preparação saudável e ativa devem produzir taxas de pico espontâneas entre 5-10 Hz com ataques de natação fictícios ocorrendo a cada poucos segundos.

Além de revelar o estado de atividade motora, as gravações radiculares ventrais podem servir como proxy para o monitoramento de atividades diferentes que descarregam paralelamente aos comandos motores para atenuar a atividade da linha lateral^30,31,32, bem como atividade em sistemas de células ciliadas homólogos (por exemplo, o sistema auditivo e vestibular^35,43,44,45). Os neurônios eferentes residem profundamente no cérebro traseiro, tornando as gravações eletrofisiológicas deles extremamente desafiadoras. O zebrafish é um sistema genético modelo, e nosso protocolo de eletrofisiologia pode ser complementado por linhas transgênicas para investigar poderosamente aspectos da descarga corolária, sensibilidade das células ciliadas, excitotoxicidade e além.