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Neuroscience

얼룩말피에서 수영하는 동안 후방 측면 라인 발신 신경의 활동

Published: February 10, 2021 doi: 10.3791/62233
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Florida, The Whitney Laboratory for Marine Bioscience

Summary

우리는 모델 척추 동물 머리 세포 시스템에서 모터 명령 중 발포성 뉴런 활동의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

감각 시스템은 행동을 지시하는 데 필수적인 단서를 수집하지만 동물은 생물학적으로 관련된 정보를 해독해야합니다. 운동운동은 동물이 주변 환경의 관련 감각 단서에서 벗어나야 한다는 재흡수성 단서를 생성합니다. 예를 들어, 물고기가 수영할 때, 신체 기복으로부터 생성된 흐름은 모발 세포를 포함하는 기계광 신경종에 의해 검출되어 측면 선 시스템을 구성한다. 모발 세포는 감각 발포성 뉴런을 통해 센서에서 뇌로 유체 운동 정보를 전송합니다. 동시에, 모터 명령의 동시 방전은 감각 과부하를 방지하기 위해 모발 세포에 릴레이된다. 운동 중 예측 모터 신호의 억제 효과를 고려하므로 측면 선 시스템의 감도를 평가할 때 매우 중요합니다. 우리는 몇 시간 동안 지속될 수 있는 제브라피시 애벌레(4-7일 후 수정)에서 후방 측면선 발포성 뉴런 및 복부 모터 루트 활성을 동시에 모니터링하는 생체 내 전기생리학적 접근법을 개발했습니다. 포이발성 뉴런의 세포외 기록은 단일 또는 다중 뉴런에서 활동을 감지할 수 있는 느슨한 패치 클램프 기술을 사용하여 달성됩니다. 복부 뿌리 기록은 모터 뉴런 활동을 검출하기 위해 유리 전극으로 피부를 통해 수행됩니다. 당사의 실험 프로토콜은 척추동물과 동작하는 그대로 모터 동작에 걸쳐 내인성 또는 유발된 감각 입력의 변화를 모니터링할 수 있는 잠재력을 제공합니다.

Introduction

메카노 감각 시스템의 발포성 뉴런은 청력과 균형 동안 모발 세포에서 뇌로 정보를 전송합니다. 전기 생리학은 직접 기록을 통해 포성 뉴런의 감도를 나타낼 수 있습니다. 모발 세포에서 전체 세포 패치는 어려울 수 있지만, 다운스트림 포성 뉴런에서 기록하는 것은 더 쉬우며 제어 자극1,2,3에대한 응답으로 작용 잠재력의 평가를 할 수 있습니다. 자극하는 모발 세포는 메카노감각 구조를 수정하는 편향으로 이어지므로 포근성 뉴런4,5,6에서작용 잠재력(스파이크)의 증가를 유발한다. 외부 자극이 없는 경우, 발포성 뉴런은 모발 세포로부터 발구성 시냅스 후 단자7,8로글루타민트 누출로 인해 자발적으로 스파이크하고, 감도9,10을유지하는 데 기여하는 것으로 나타났다. 포어런트 활성의 패치 클램프 레코딩을 사용하면 미세포닉스11,12 또는 기능성 칼슘 이미징13,14,15와같이 낮은 측두해상도기술을 사용하여 사용할 수 없는 모발 세포 민감도 및 신호 역학을 관찰할 수 있다. 다음 프로토콜은 모터 명령과 동시 적으로 발포성 활동의 기록을 통해 모발 세포 민감도의 즉각적인 변화를 나타낼 수 있게 합니다.

Zebrafish(Danio rerio)는항비16,17,18,육식 동물 회피, 먹이 포착19,20및 학교21에필수적인 신경 신호로 변환되는 신체에 비해 물 움직임을 감지하기 위해 측면 라인 시스템을 구성하는 신경 종에 함유 된 모발 세포를 사용합니다. 또한수영22,23,24,호흡22,25,26,및수유(27)의 움직임에 의해 수유를 자체 생성할 수 있다. 이러한 동작은 모발 세포를 피로하고 감지를 손상시킬 수 있는 반복적인 움직임을 포함합니다. 따라서 측면 선 시스템은 외부(exafferent)와 자체 생성(reafferent) 흐름 자극을 구별하는 것이 중요합니다. 모조부에서 운동하는 동안 자체 생성 된 흐름 신호를 감쇠하는 계수 방전. 이러한 억제 예측 모터 신호는 내림내뉴런을 통해 감각 수용체로 중계되어 입력을 수정하거나 재흡수피드백(28,29)의처리를 방해한다. 이 이송형 시스템의 초기 이해에 기여하는 정액 작업은 신경 회로의 연결및 내인성 활동이 유지되지 않은 시험관 내 제제에 의존하여28,30,31,32,33,34, 35. 이 프로토콜은 내인성 피드백 역학이 유지되므로 생체 내 의 계수 방전을 더 잘 이해할 수 있도록 유지되는 온전한 신경 회로를 보존하는 방법을 설명합니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 후반면 라인 발포성 뉴런과 운동 신경 활동을 동시에 애벌레 얼룩말피에서 모니터링하는 방법을 설명합니다. 운동 명령 전, 도중 및 운동 후 발포성 신호 역학을 특성화하면 운동 중에 모발 세포 민감도를 조절하는 중추 신경계의 실시간 내인성 피드백에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 실험 전에 준비해야 할 물질을 설명하고 제브라피시 애벌레를 마비시키고 준비하는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 운동 뉴런의 포근 과 세포 외 복부 루트 (VR) 기록의 안정적인 느슨한 패치 기록을 설정하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻을 수 있는 대표적인 데이터는 모범적인 개인으로부터 제시되고 실험 프로토콜의 여러 복제에 대한 분석이 수행되었다. 데이터의 사전 처리는 MATLAB의 사용자 지정 서면 스크립트를 사용하여 수행됩니다. 전반적으로, 생체 내 실험 패러다임은 모델 척추동물 모발 세포 시스템에서 운동 중 감각 피드백에 대한 더 나은 이해를 제공할 태세입니다.

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Protocol

모든 동물 관리 및 실험은 플로리다 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인 한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 전기 생리적 기록을 위한 재료 준비

  1. 실리콘 엘라스토머 바닥 녹음 접시를 만드십시오.
    1. 실리콘 엘라스토머 성분(예: 실가드)을 커버 글래스 바닥 조직 배양 접시에 분배하여 얕은 우물의 테두리와 함께 레벨을 넘습니다. 약 0.5 mL이 충분합니다.
    2. 실온에서 최소 48시간 동안 접시를 덮고 치료하십시오.
  2. 해부 핀을 만듭니다.
    1. DC 전원 공급 장치를 사용하여 100mL 의 에트텐 비커(3M KOH)에 음전하(5V)를 제공하고 텅스텐 와이어(0.002인치; 50.8 μm 직경)를 양전하 출력에 부착한다.
      주의: 잠재적인 화재 위험을 초래할 수 있는 불꽃을 생산할 위험이 있으므로 이 절차 중에 음수 및 양수 와이어가 서로 연락해서는 안 됩니다.
    2. 에칭 텅스텐 와이어신속하고 반복적으로 팁이 날카로운 지점으로 좁힐 때까지 에탕 목욕에 와이어의 끝을 찍어. 스테레오현미경 아래에서 가장자리 면도날로 끝에서 약 1mm 의 와이어를 잘라냅니다. 세 번 더 반복한 다음 미세 한 집게를 사용하여 경화 된 녹음 접시에 핀을 삽입합니다.
  3. 기록 전극을 준비합니다.
    1. 후방 측면선에서 포근뉴런을 기록하는 데 사용되는 약간의 테이퍼(그림1 Ai)로30 μm 직경 팁으로 상자 필라멘트가 있는 수평 마이크로피펫 풀러를 사용하여 보로실리케이트 유리 모세관 튜브(내부 직경: 0.86mm, 외경: 1.50mm)를 잡아당깁니다.
    2. 추가 보로실리케이트 유리 모세관 튜브를 더 작은 팁 직경(1-5 μm)이 있는 전극 한 쌍으로 당깁니다. 각 손에 하나의 전극을 들고, 부드럽게 서로를 가로 질러 팁을 실행하면 ~ 30 ° 각도로 끊습니다. 마이크로 포지를 사용하여 베벨팁을 부드러워질 때까지 닦습니다. 최종 팁 직경은 30-50 μm 사이여야 하며 복부 뿌리(VR) 기록전극(도 1 Aii)으로사용됩니다.
    3. 전극을 헤드 스테이지의 파이펫 홀더에 삽입할 때 팁 조리개를 아래쪽으로 방향을 지정하는 데 도움이 되는 영구 잉크로 VR 전극의 측면을 표시합니다(3.2단계).
      참고: VR 기록 전극의 기계적 변형은 부정확하며 1.3.2 단계는 연마 하기 전에 적절한 팁 형태가 달성 될 때까지 여러 번의 시도가 필요할 수 있습니다. VR 레코딩 전극은 애벌레의 체체 곡선에 부합하도록 베약된다. 일단 제작되면 실험 사이에 팁이 명확하고 깨끗한 상태로 유지되는 한 VR 기록 전극을 반복적으로 사용할 수 있습니다.
  4. 전기 생리학 기록 프로그램에서 프로토콜을 생성합니다.
    1. 오른쪽 헤드스테이지가 흡혈기 뉴런 레코딩을 위한 마이크로전극 전류 및 전압 클램프 증폭기 뒷면의 채널 1 입력에 연결되어 있는지 확인하고 왼쪽 헤드스테이지는 VR 레코딩을 위한 채널 2 입력에 연결됩니다.
      참고: 전류 및 전압 클램프 증폭기용 컴퓨터 사양에는 1Ghz 또는 더 나은 프로세서, Windows XP Pro 또는 Mac OS X 10.46.6, 512 MB RAM, 500MB 하드 드라이브 공간 및 2 개의 USB 포트가 있는 CD-ROM 드라이브가 필요합니다.
    2. 컴퓨터 제어 증폭기 소프트웨어를 엽니다.
    3. 채널 1과 채널 2를 각 채널의 IC 버튼을 클릭하여 현재 클램프 모드로 설정합니다.
    4. I-클램프 1과 I-클램프 2 탭 아래에 다음 매개 변수를 입력합니다. 1차 출력: 100x AC 멤브레인 잠재력 (100,000 mV / mV), 게인: 1,000, 베셀: 1 kHz, AC: 300 Hz , 범위: 바이 패스 . 보조 출력: 100x AC 멤브레인 전위 (100 mV /mV) , 게인: 1, 로우 패스 필터 : 10 Hz.
    5. 채널 매개 변수를 Ch1_Aff 저장하고 Ch2_VR.
    6. 패치 클램프 전기생리학 소프트웨어를 설치하고 엽니다.
    7. BNC 동축 케이블을 통해 연결된 디지털화 채널(예: 아날로그 IN #0 및 아날로그 IN #1)에 Ch1_Aff 및 Ch2_Vr 추가하여 해당 채널 1 및 채널 2 배율 출력에 연결하는 랩 벤치 구성 및 선택을 클릭합니다. 확인을 클릭합니다.
      참고: 디지타이저에 대한 최소 컴퓨터 요구 사항은 1 Ghz 또는 더 나은 프로세서, Windows XP Pro 또는 Mac OS X 10.46.6, CD-ROM 드라이브 512 MB RAM, 500MB 하드 드라이브 공간, 2 개의 USB 포트입니다.
    8. 획득을 클릭하고 새 프로토콜을선택합니다.
    9. 모드/속도 탭에서 간격을 선택합니다. 획득 모드에서 평가판 길이를 설정하여 사용 가능한 디스크 공간(예: 중지될 때까지 기록) 또는 원하는 설정된 지속 시간(hh:mm:ss)을 사용한 다음 신호당 샘플링 속도를 20,000으로 설정하여 해상도를 최대화합니다.
    10. 입력 탭에서 이전에 구성된 아날로그 IN 채널(1.4.6단계)을 선택하고 해당 채널에 대해 Ch1_Aff 및 Ch2_VR 선택합니다.
    11. 출력 탭에서 채널 #0 채널 #1 Cmd 0과 Cmd 1을 각각 선택합니다.
      1. 증폭기의 채널 1 명령을 BNC 동축 케이블을 통해 디지털화기에 아날로그 Ouput 0에 연결하고 채널 2 명령을 아날로그 출력 1에 반복합니다.
    12. 나머지 탭은 기본 설정 아래에 남아 있습니다. 확인을 클릭하고 프로토콜을 저장합니다.

2. 솔루션 준비

  1. 행크의 용액 준비: 137 mM NaCL, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4,0.44 mM KH2PO4,1.3 mM CaCl2,1.0 mM MgSO4,4.2 mM NaHCO4; pH 7.3. 적정량의 탈온수를 증액에 첨가하여 10%의 행크의 용액을 희석시.
  2. 세포외 용액 준비: 134 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.2 mM MgCl2,2.1 mM CaCl2,10 mMM 포도당, 10 mM HEPES 버퍼; pH 7.8 NaOH와 함께 조정. 0.22 μm 모공 크기의 필터를 통해 진공 필터 세포 외 용액.
  3. α -bungarotoxin 준비: 10 mL 세포 외 용액에 리옹 α-분가로톡신 1 mg을 녹여 0.1% 희석을 생성합니다.
  4. 안락사 용액 준비: 50% (mg/L) 버퍼링 된 제약 등급 MS-222 에서 10% 행크의 솔루션.
    주의: α 분가로톡신은 콜린성 수용체를 차단하여 근육을 마비시키는 강력한 신경 독소입니다. 장갑이 필요하며 마비를 처리하는 동안 눈 보호가 권장됩니다.

3. 전기 생리학적 기록을 위한 애벌레 의 준비

  1. 제브라피시 애벌레를 고정합니다.
    1. 27°C에서 제브라피쉬(Daniorerio;4-7일 후 수정)와 집안의 실험실 사육 집단으로부터 유충을 사용한다.
    2. 하우징에서 작은 페트리 접시(35mm)로 유충을 대형 팁 이송 파이펫을 사용하여 옮기고 가능한 한 주변 용액을 제거합니다.
      참고: 배아 용액을 제거하면 마비의 희석을 방지하고 효능이 증가합니다. 작업 와이프의 구석은 나머지 배아 용액을 심기 위해 사용할 수 있으며 애벌레에게 연락하거나 유충을 공기에 노출시키지 않는 것이 중요합니다.
    3. 약 5 분 동안 0.1 % α 분가로톡신의 10 μL에 유충을 침수하십시오.
      참고: 애벌레를 고정하는 데 필요한 시간은 준비마다 다릅니다. 건강한 준비는 지속적인 빠른 혈류와 감소된 운동 반응을 면밀히 모니터링하는 데 달려 있습니다. 마비에 대한 짧은 과다 노출은 철저한 세척 후에도 전체 적인 건강이 느려질 수 있습니다. 애벌레가 완전히 고정되기 전에 세척을 적용하는 것이 가장 좋습니다.
    4. 마비된 애벌레를 세포외 용액으로 씻고 10분 동안 목욕하십시오.
      참고: 세척을 통해 애벌레는 미묘한 근육 진동에서 마비로 전환할 수 있습니다. 또한, α-분가로톡신은 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChR) α9-서브유닛의 길항제이며, 이는 내인성 피드백 회로의 중요한 성분이다. 그러나, 이러한 효과는 10분 세척 후 제노푸스 와 제브라피시 모발 세포에서 가역가능한 것으로 나타났다36,29.
  2. 녹음 접시에 물고기를 핀.
    참고: 마취(예를 들어, MS-222, 트리카인)는 동물의 건강을 방해하기 때문에 애벌레 얼룩말피(4-7dpf)를 준비하는 동안 필요하지 않습니다. 사실, 애벌레 얼룩말 물고기는 특정 척추 동물 프로토콜에서 면제됩니다.
    1. 이송 파이펫을 사용하여, 외세포 용액 욕조에서 실리콘 바닥 녹음 접시로 애벌레를 이동합니다. 나머지 접시를 세포외 용액으로 채웁니다.
    2. 스테레오현미경의 밑에, 실리콘 매트의 중앙 위에 미세 한 양면으로 애벌레를 부드럽게 배치, 측면 은 신체의 전방및 후방 끝, 각각 왼쪽에서 오른쪽으로 실행. 그런 다음 미세 한 팁 포셉을 사용하여 실리콘 매트에서 에칭 핀을 잡고 항문에 직접 애벌레의 등간 노토 코드를 통해 실리콘에 고정 핀을 삽입합니다. 두 번째 핀을 꼬리 끝 부근의 노토코드를 통해 삽입하고 가스 방광의 노토코드 등쪽을 통해 세 번째 핀을 삽입한다(도1B).
      참고: 핀을 삽입하는 동안, 혈액 흐름을 방해하거나 주변 근육을 손상시키는 것을 방지하기 위해 노토코드 폭의 중심을 대상으로 하는 것이 중요합니다. notochord는 후방 측면 라인 신경에 등대이므로 적절한 고정으로 측면 라인 감각 뉴런에 손상이 예상되지 않습니다. 주변 조직을 방해하지 않도록 첫 접촉 후에 삽입하십시오. 이상적으로, 핀의 직경은 깨끗한 삽입을 보장하기 위해 notochord의 절반 폭 미만입니다. 핀이 이 너비를 초과하면 원하는 핀 너비가 도달할 때까지 1.2단계를 반복합니다. 고정 후 혈류가 느려지면 새로운 시편으로 1.3 단계에서 반복하십시오.
    3. 핀이 캡슐화(도1B)에삽입될 때 전방을 향해 약간의 회전을 제공하면서 오틱 소포를 통해 네 번째 핀을 삽입합니다. 약간의 회전이 적용됨에 따라, 자극성 소마타의 클러스터를 드러내기 위해 클리트럼과 오정 소포 사이의 조직을 조심하십시오.
      참고: 네 번째 핀의 각진 삽입은 큰 오틱 소포에 의해 방해되는 후방 측면 라인 발포성 신경절의 노출을 보장하는 것입니다.

4. 복부 뿌리 녹음

  1. 고정된 단계 차동 간섭 대조(DIC) 직립 현미경에 10배 물 침수 목표 아래에 고정된 애벌레를 놓고 왼쪽 헤드스테이지 접근법벡터(도 1B)와평행한 근육 블록의 근막 갈라짐을 방향을 지정한다.
    1. 광학 에어 테이블에 떠있는 고정 단계 DIC 현미경은 진동이 녹음을 방해하지 않도록 하는 데 가장 적합합니다. 전동 포지셔터를 사용하여 현미경은 준비 및 헤드 스테이지가 장착된 고정 된 단계 주위를 자유롭게 이동할 수 있습니다(그림 1C).
    2. 접지 와이어를 목욕 용액에 넣고 왼쪽 헤드 스테이지에 연결되어 있는지 확인합니다.
  2. 유연한 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 세포 외 용액의 30 μL로 VR 기록 전극을 채우고 왼쪽 헤드 스테이지 파이펫 홀더에 삽입하십시오.
  3. 공압 트랜스듀서에 의해 생성된 양압(1-2 mmHg)을 가하는 동안 마이크로 조작기로 녹음 파이펫을 접시 용액으로 낮춥니다. 10배 배율 하에서 팁 조리개 방향이 아래쪽으로 향하고 있는지 확인합니다.
    1. 공압 트랜스듀서는 실리콘 튜브를 통해 파이펫 홀더 포트에 연결되어야 합니다.
  4. VR 전극을 근셉텀에 놓습니다.
    1. 마이크로 조작기를 다시 사용하여, 유충 위에 위치를 보유 할 때까지 VR 전극 팁을 낮춥다. 배율을 40배로 늘립니다.
    2. 갈라진 이 VR 전극 팁 조리개(도1D)를중심으로 할 때까지 두 개의 심소미어 사이의 근막 위에 전극 팁을 측면 선으로 가져옵니다.
    3. 팁 조리개 가장자리가 상피에 부드럽게 닿을 때까지 파이펫을 낮춥춥시다. 초기 접촉 후, 파이펫을 대각선으로 기동하여 최첨단이 접촉하고 씰을 생성할 수 있도록 합니다.
    4. 공압 트랜스듀서와 음압(~100mm Hg)을 적용하고 보관합니다.
      참고: 근막과 연속 음압에 비해 VR 파이펫의 적절한 방향은 피부를 통해 높은 신호 대 잡음 비율로 모터 뉴런 활동을 감지하도록 최적화합니다.
  5. 모터 뉴런 활동을 감지합니다.
    1. 왼쪽 헤드 스테이지는 증폭된 신호를 인접한 컴퓨터에서 모니터링할 패치 클램프 전기 생리학 소프트웨어로 출력하는 디지타이저로 릴레이하는 증폭기에 연결되어야 합니다(섹션 1.4 참조).
    2. 패치 클램프 소프트웨어에서 도구 모음의 재생 버튼을 클릭하여 VR신호(그림 1E)를모니터링합니다.
    3. 잘 고정 관념 버스트 신호 역학을 가진 모터 뉴런 활동이 관찰되면 VR 레코딩이 달성되고 있는지확인 29,37 (도 1E).
      참고: 가상의 수영 시합은 마비된 준비에도 불구하고 계속 전송되는 VR 모터 뉴런의 활동 패턴입니다. 따라서, 가상의 수영은 동물의 행동 상태를 결정하고 동시에 고정 된 준비가 필요한 포전성 뉴런 기록을 수행하면서 운동 파라미터를 측정하는 접근 가능한 수단이다. 우리의 손에, 일단 VR 녹음이 달성되면, 건강한 준비는 몇 초마다 자발적인 가상의 수영 시합을 유도합니다. 건강한 준비는 빠른 혈류를 지속했다는 것을 기억하십시오. 충분한 VR 신호를 얻는 데는 몇 분이 걸릴 수 있으며 초기 감지 후 신호 대 잡음 비가 향상될 수 있습니다. 시간의 이익을 위해 섹션 5로 이동하는 것이 허용됩니다.
    4. 섹션 5를 완료한 후에도 VR 레코딩이 아직 달성되지 않은 경우, 유충 건강이 여전히 최적인 경우, 음압을 방출하고, 전극을 높이고, 4.4.2 단계에서 다른 묘세텀에서 반복한다.

5. 포퍼트 뉴런 레코딩

  1. 세포 외 용액의 30 μL로 발신 기록 전극을 채우십시오. 공압 트랜스듀서에 의해 생성된 양압(1-2mm Hg)을 적용하면서 오른쪽 헤드스테이지 파이펫홀더(도 1B,C)에삽입하여 접시 용액에 하강한다.
  2. 후방 측면 줄 에 느슨하게 부착하여 포동성 신경절을 찾습니다.
    1. 마이크로 조작기를 사용하여, 그것은 cleithrum 위의 위치를 보유 할 때까지 발포성 전극 팁을 낮춥다.
    2. 배율을 40배로 늘리고 후방 측면선 신경과 클리스럼의 교차를 찾습니다. 경석에서 측면 선 신경 전방을 따라 섬유가 후방 측면선 발포성 신경절을 내면으로, 소마의 이산클러스터(도 1F)에의해 구별된다.
    3. 전극 끝을 포퍼런트 신경절 위에 넣고 팁이 상피에 닿을 때까지 파이펫을 낮춥춥시다. 부드럽게, 전체 팁 둘레가 포운성 신경절에 닿도록 전극을 기동.
    4. 공압 트랜스듀서와 음압(20-50mm Hg)을 적용하고 유지합니다.
      참고: 흡개성 신경절에 가해지는 음압은 복부 뿌리 기록 중에 적용되는 흡입보다 더 부드럽습니다. 음압이 증가하면 신호 대 잡음을 향상시킬 수 있지만 지속적인 공격적인 흡입으로 포성 뉴런 건강이 감소하여 성공적인 기록의 확률을 감소시킵니다.
  3. 발신 신경 활동을 기록합니다.
    1. 4.5.1 단계에서 설명된 것과 유사한 순서로 올바른 헤드스테이지가 연결되어 있는지 확인합니다.
    2. pClamp10에서 도구 모음의 재생 버튼을 클릭하여 포퍼트 뉴런과 VR 신호를 동시에 모니터링합니다.
    3. 전체 세포, 포성 뉴런의 느슨한 패치 기록이 스파이크가 자발적으로 발생하면, 대략 매 100-200 ms1,29 (그림 1E)마다달성되는지 확인합니다.
    4. 점차적으로, 대기 (0mm Hg)로 다시 전극 압력을 기록 하는 포퍼런트 뉴런을 증가 하 고 기록의 나머지 부분에 대 한 유지.

6. 데이터 수집

  1. 동시 녹화.
    1. 포이퍼트 뉴런과 운동 뉴런 활동이 모두 감지되면 pClamp10의 도구 모음의 레코드 버튼을 클릭하여 두 채널 모두에서 동시 간격 무료 레코딩을 캡처합니다.
    2. 원하는 지속시간(그림 1E)에대한 기록.
      참고: 건강한 준비의 레코딩은 몇 시간 동안 지속될 수 있으며 외부 자극에 계속 반응할 수 있습니다.
    3. 수집 매개 변수와 같은 메타데이터를 보존하기 위해 레코딩을 지원되는 파일 유형(.abf, pClamp10)으로 저장합니다.

7. 안락사

  1. 공압 트랜스듀서를 사용하여 포전 및 VR 레코딩 전극에 양압(10mm Hg)을 적용하고 마이크로 조작기를 사용하여 녹음 접시에서 전극을 올립니다.
  2. 고정 단계 DIC 현미경에서 해부 스테레오 현미경으로 녹음 접시를 전송합니다.
  3. 미세 팁 집게를 사용하여 노토코드 및 오틱 캡슐에서 텅스텐 핀을 제거하고 최소 5 mL의 안락사 용액을 포함하는 페트리 접시 (35mm)로 이송 파이펫을 사용하여 애벌레를 전송하십시오.

8. 사전 처리 및 데이터 분석

참고: 데이터 사전 처리 및 분석에는 명령줄 코딩에 대한 기본적인 이해가 필요합니다.

  1. 사전 처리를 위해 레코딩 파일을 변환합니다.
    1. Matlab 소프트웨어를 설치합니다.
    2. 사용자 지정 서면 스크립트, abfload.m38을 다운로드하고 원시 녹음 파일을 저장하는 동일한 폴더에 파일을 저장합니다.
    3. Matlab 편집기 창에서 abfload.m 열고 도구 막대에서 실행을 클릭합니다. 메시지가 표시되면 폴더 변경을선택합니다.
    4. 원시 레코딩 파일을 입력으로 명령 창에서 함수를 실행합니다.
      > [d,si,h] = abfload('[원시 녹음 파일 이름].abf')
      [표본 번호]_[dpf]_[원시 기록 파일 이름(기본적으로 실험 날짜 포함)]와 같은 애벌레 지정, 나이 및 실험 날짜가 포함된 파일 이름으로 출력 작업 영역을 저장합니다.
      참고: 변환된 파일 이름에는 설명된 정수만 포함해야 합니다.
  2. 데이터 사전 처리를 수행합니다.
    1. 작성자 작성 한 사용자 정의, AffVR_preprocess.m Matlab 스크립트 및 관련 기능을 다운로드합니다.
    2. 편집기 창에서 AffVR_preprocess.m 열립니다.
    3. 변수하에서신호 대 잡음 비율의 기록에 따라 포렌타트 및 VR 레코딩(spk_detect_lb 및 vr_detect_lb,8호선 및 14호선)에 대해 하한 스파이크 감지 임계값을 조정합니다.
      참고: 스파이크 감지는 수동 임계값에 의존하여 진폭으로 하나 이상의 포퍼런트 뉴런에서 신호를 정렬하고 격리합니다. 다른 단위의 기준 노이즈 및 활동은 임계값에 의해 필터링되어 최대(예: spk_detect_ub)의 백분율(예: spk_detect_lb) 내의 스파이크 진폭만 포함합니다. 임계값은 또한 모터 활동 스파이크의 정확한 비닝을 버스트 및 집단 가상 의 수영 시합으로 보장합니다. 일반적으로 0.5의 낮은 임계값으로 시작하여 정확한 검출이 이루어질 때까지 점차 감소합니다. 예를 들어, spk_detect_lb 0.5로 설정하고 spk_detect_ub 1.0으로 설정하면 스파이크 진폭의 50%와 같거나 큰 모든 스파이크를 최대 50% 이상 감지하고 낮은 스파이크 진폭의 소음 또는 추가 뉴런을 배제한다(그림2A). 양자 택일로, 하나는 또한 낮은 스파이크 진폭의 뉴런을 격리하기 위해 높은 스파이크 진폭의 뉴런을 제외하기 위해 1.0에서 spk_detect_ub 낮출 수 있습니다. 사전 처리 수치 출력(단계 7.2.6 참조)은 7.2.2 단계에서 조정 및 반복이 필요한지 여부를 알려줍니다.
    4. 편집기 창에서 실행을 클릭하여 AffVR_preprocess.m 실행합니다.
    5. 이전에 변환된 .mat 데이터 파일로 이동(단계 7.1.3 참조) 열기를 선택하고 클릭하여 자동화된 전처리를 시작합니다.
      참고: 사용자 지정 스크립트가 실행되는 동안 "데이터 필터링...", "복부 뿌리 활동 감지...", "수치 생성..."과 같은 처리 단계를 통해 진행 상황을 알리는 출력이 명령 창에 나타납니다.
    6. AffVR_preprocess.m 생성된 수치는 포렌트 스파이크 및 VR 감지를 시각화하고 분석 변수를 조정해야 하는지 여부를나타냅니다(그림 2).
    7. 키보드에 "Y"를 입력하여 미리 처리된 메타데이터를 preprocess_output 폴더에 저장합니다.
    8. 사전 처리된 데이터는 자동으로 data_out.xls.
  3. 미리 처리된 데이터를 원하는 대로 분석합니다.

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Representative Results

제브라피시 애벌레가 제대로 고정되고 후방 측면선 포렌트 신경절및 VR 레코딩이 달성된 후, 포퍼런트 및 모터 뉴런 모두에서의 활동을 동시에 측정할 수 있다. 녹화 채널은 비응성 및 VR 활동을 지속적으로 모니터링하기 위해 간격이 없는 레코딩 프로토콜(단계 1.4)을 사용하여 표시됩니다. 실시간으로, 자발적인 포성 스파이크 속도의 감소는 가상의 수영 시합을 나타내는 VR 활동과 동시 관찰될 수있다(그림 1E). 최상의 결과와 정확한 스파이크 감지는 최소 0.5의 신호 대 노이즈 비율을 달성한 레코딩 제품임을 발견했습니다. 사용자 정의 서면 사전 처리 스크립트는 포퍼런트 및 VR 스파이크 감지의 시각화를 지원하기 위해 플롯을 생성합니다. 자발적인 포이퍼트 스파이크는 임계값, 최소 지속 시간(0.01 ms) 및 최소 간 스파이크 간격(ISI; 1 ms)과 같은 스파이크 매개 변수의 조합을 사용하여 식별됩니다. 기록을 설정하는 동안 음압을 증가하면 종종 한 번에 여러 포퍼트 단위의 신호 감지를 얻을 수 있습니다. 진폭에 의한 필터링을 통해 독립적인 흡인의 신호 역학을 구별할 수 있습니다. 사전 처리스크립트(그림 2A)에서하한 및 상한 검출 변수를 조정하여 신호를 격리할 수 있습니다. 다중 유닛 레코딩을 달성하기 위한 적극적인 흡입은 불안정한 녹음, 기계적 노이즈, 흡근 건강저하 및 궁극적으로 신호 손실로 이어질 수 있습니다. 따라서 원하는 신호가 달성되면 대기압으로 흡입을 천천히 다이얼하는 것이 중요합니다. 복부 루트 스파이크 감지는 포근스파이크 검출과 동일한 매개변수를 따르지만 뚜렷한 가상의 수영 시합을 정의하기 위해 추가 입력이 필요합니다. 모터 커맨드 내의 버스트는 VR 활동에 의해 정의되며, 서로 0.1ms 이내의 최소 2개의 스파이크를 기록하며 최소 5ms를 지속합니다. 모든 수영 시합은 <200 ms(그림 2B)의인터 버스트 간격으로 최소 세 번의 버스트로 묘사됩니다.

방음 활동은 전체 녹음을 볼 때 해석하기 어렵다. 사전 처리 스크립트는 잘 정의된 관심 기간을 중심으로 한 포퍼런트 활동의 섹션을 오버레이하며,이 경우 스윔 시합(n = 33, 그림 2C)의발병을 통해 신호 역학의 추세를 시각화하는 데 도움을 줄 것입니다. 즉각적인 발포활성은 이동 평균 필터와 100ms 샘플링 창을 사용하여 계산됩니다. 즉 자발적 인 활동은 모터 활동의 발병에 대한 응답으로 극적인 변화를 나타낸다(도 2C). 더 나은 해부 및 포퍼런트 활동을 분석하기 위해, 수영 전후 기간은 해당 수영 시합의 시간 간격에 맞게 설정됩니다. 사전 처리 스크립트 및 대표 분석 결과에서 이러한 기간은 "수영 전"과 "수영 후"라고합니다. 수영 전, 수영 및 수영 후 스파이크 비율은 기간 동안 각 기간 내에 스파이크 수를 계산했습니다. 각 개인에 대한 추정의 정밀도는 부분적으로 수영 수의 함수이므로 가중치가 있는 회귀를 사용하여 가변 관계를 분석했으며 개별 가중치는 수영 수의 제곱근과 같습니다.

다양한 관심 기간(수영 전, 수영 및 수영 후)에 걸친 포이퍼트 스파이크 비율의 차이는 차이(ANOVA)의 양방향 분석을 통해 테스트되었습니다. Tukey의 포스트 혹 테스트는 수영 스파이크 속도와 수영 전 수영 (8.94 ± 0.2 Hz, 상대적 감소 57%) 사이의 스파이크 비율에 상당한 차이를 감지했습니다. 수영 후 (5.34 ± 0.2 Hz, 상대적 감소 40%) 기간. 스파이크 속도는 우리가 또한 수영 후 스파이크 비율이 전 수영 스파이크 속도보다 낮다는 것을 것을을 감안할 때 즉시 기준선으로 돌아오지 않았다 (Tukey 포스트 혹 테스트 그룹, p < 0.001; 그림 3A). 선형 모델은 상대 스파이크 속도와 가상 수영 매개 변수 사이의 관계를 감지하는 데 사용되었습니다. 상대스파이크율은 수영 전 스파이크비율을 넘어 수영 스파이크비율을 계산했다. 허구의 수영 매개 변수에는 수영 시간, 수영 빈도 (즉, 수영 시합 기간 동안 수영 시합 내의 버스트 수), 의무 주기 (즉, 수영 시합 총 기간 동안 수영 버스트 기간의 합계)가 포함되었습니다. 우리의 손에, 상대 스파이크 속도의 평균및 분산은 상관 관계가 있었다, 그래서 데이터를 분석을 위해 변환 로그 할 필요가 있었다. 포렌트 스파이크 비율은 측면 선이 더 긴 기간동안 더 큰 억제를 경험한다는 것을 의미하는 수영 기간과 부정적으로 상관관계가 있었다 (r2 = 0.186, F2,26 = 2.971, p = 0.045; 그림 3B). 상대 스파이크 속도와 수영 빈도 또는 듀티 사이클((r2 = 0.099, F2,26 = 1.431, p = 0.231, r 2=0.247, F2,26 = 0.645, p = 0.932) 사이에 는 상관관계가 감지되지 않았습니다. 그림3C,D). 변수 관계의 모든 분석은 개인당 수영 횟수에 의해 가중치가 적용되었으며 모든 변수는 각 개인(n = 29)에 의해 평균되었습니다.

Figure 1
도 1: 후방 측면선 발포성 뉴런 및 복부 모터 루트 활성의 동시 전기 생리학적 기록. (A). 느슨한 패치 포퍼런트(i)및 복부 모터 루트(ii)기록 전극의 예. 스케일 바는 50 μm을 나타낸다.(B)라발 얼룩말피쉬는 마비되어 4개 위치(크로스 심볼)에 고정되어 실가드 요리에 고정되어 안정성을 기록합니다. 굵은 십자가는 핀에 대한 삽입 지점을 나타냅니다. (C)전기생리학 장비는 진동 격리 테이블에 장착되어 40배배율을 낼 수 있는 전동 컨트롤러의 수직 고정 단계 현미경으로 구성됩니다. 이중 전류 클램프 및 전압 클램프 헤드 스테이지는 마이크로 조작기에 장착됩니다. (D)체근육의 심소는 운동 신경 절기에 대한 기록 랜드마크 역할을 하는 근셉파에 의해 분리된다. 복부 모터 루트 전극은 복부 몸체(왼쪽)에 접근하고 심근(화살촉)의 위에 중심과 내리막이 있습니다. 스케일 바는 50 μm을 나타낸다.(E)자연발성 활성(채널 1)의 시각화를 허용하고 가상의 수영 시합(채널 2)을 나타내는 파열하는 복부 근동을 실시간으로 전기생리학적 레코딩의 스크린 캡처한다. 레코드 및 재생 버튼은 빨간색 화살표로 표시됩니다. (F)후방 측면 선 발포성 신경절(dashed line)은 피부 바로 아래에 놓여 있으며, 발포성 소마의 단단한 클러스터에 의해 식별될 수 있다. 신경절은 클리스럼 뼈(화살표헤드)를 지나 신경절에 연결되는 측면 선 신경을 따라 신경절에 연결하여 위치할 수 있다. 배율 막대는 30 μm을 나타냅니다.

Figure 2
그림 2: 사전 처리 그림 출력은 정확한 스파이크 감지를 시각화합니다. (A)후측라인 발신신경의 세포외, 느슨한 패치 기록. 이산 스파이크(빨간색 점으로 레이블이 지정)는 최소 1ms의 연속 간 간격으로 감지됩니다. 다른 유닛의 기준 노이즈 및 활동은 최대 치수의 50% 이내의 스파이크 진폭만 포함하도록 임계값에 의해 필터링됩니다. (B)가상의 수영 시합의 복부 모터 루트 레코딩(VR)은 녹음 기간 내내 자발적인 모터 명령을 드러낸다. VR 스파이크(빨간색 점)는 유사한 임계값 필터를 사용하여 감지한 다음 200ms 내의 활동 파열을 감지하여 단일 수영 시합(녹색)으로 비닝됩니다(삽입 참조; 스케일 바는 200ms를 나타냅니다). 정의된 수영 시합 외부에서 감지된 스파이크는 고정 관념버스트 활동의 교차 스파이크 간격 내에서 발생하지 않으므로 제외됩니다. (C)수영 전, 도중, 수영 후 스파이크 속도를 보여주는 각 수영 시합(시간 =0s)의 발병을 중심으로 자발적인 포이퍼트 스파이크 비율을 의미합니다. 오류 막대는 sEM± 나타냅니다.

Figure 3
그림 3: 전, 도중, 그리고 가상의 수영 후 의 발포활성의 정량화. (A)배구스파이크율은 수영 중 현저히 감소하며, 이 효과는 그 후에도 지속된다. 통계적으로 유사한 그룹은 a 및 b.(b)더 긴 수영 기간에 의해 표시되어 감소된 흡기 스파이크 속도와 상관관계가 있다. (C-D) 수영 빈도와 수영 의무 주기는 포이퍼트 스파이크 속도와 상관 관계가 없습니다. 모든 값은 통계 적 중량이 낮은 SEM± 아웃아웃된 개인을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

설명된 실험 프로토콜은 척추동물과 동작하는 그대로 모터 거동에 걸쳐 감각 입력의 내인성 변화를 모니터링할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 특히, 유충 제브라피시의 측면 선 포성 뉴런과 복부 모터 뿌리의 동시 세포 외 레코딩을 수행하는 생체 내 접근법을 자세히 설명합니다. 자발적인 발포활성은 이전에 잠재적 동시모터활동1,2,39,40,41을고려하지 않고 제브라피시를 특징으로 하였다. 복부 뿌리 기록과 모터 활동의 존재를 모니터링하지 않고, 발포활성을 해독하는 것은 자발적인 수영 중, 심지어 그 후에도 효능 억제의 영향으로 인해 과소평가될 가능성이 높다.

생체 내 전기 생리학적 기록은 본질적으로 도전적입니다. 우리의 경험에서, 건강한 준비를 유지하는 것은 발신 성 뉴런과 복부 모터 뿌리를위한 성공적이고 오래 지속되는 기록을 달성하기위한 단일 가장 큰 요소입니다. 이렇게 하려면 빠른 혈류를 식별하고 모니터링 할뿐만 아니라 피부와 기본 근육의 질감을 인식하는 것이 중요합니다. 우리는 건강한 애벌레의 본질적인 혈류 및 피부 상태에 익숙해지기 위하여 추가 취급하기 전에 현미경의 밑에 몇몇 마비된 애벌레를 관찰하는 것이 좋습니다. 피부를 통해 성공적인 복부 뿌리 레코딩은 레코딩 전극이 단단한 씰을 생성하기 위해 부드럽고 건강한 피부 표면이 필요합니다. 이 접근법은 전통적인 프로토콜37,42가 침략적이고 시간이 많이 소요되는 것을 우회하며, 이는 근본적인 근육을 드러내기 위해 상피를 해부할 것을 요구합니다. 피부를 통해 기록의 불편은 신호가 실현되기 전에 시간에 잠재적 인 가변성입니다. 적용된 음압의 크기와 지속 시간을 최적화하면 신호를 설정하는 데 필요한 시간이 줄어들고 신호 대 잡음 비율을 잠재적으로 개선할 수 있습니다. 건강하고 활동적인 준비의 기록은 몇 초마다 발생하는 가상의 수영 시합과 5-10 Hz 사이의 자발적인 포이포성 스파이크 속도를 산출해야합니다.

모터 활동 상태를 드러내는것 외에도, 복부 루트 레코딩은 횡선활성을감쇠시키기 위해 모터 명령에 평행하게 배출되는 효율적 활성을 모니터링하는 대리역할을 할 수 있으며, 동종 모발 세포 시스템(예를 들어, 청각 및 전정 시스템35, 43,44, 45)에서의활동뿐만 아니라 활성을 감쇠시킬 수 있다. Efferent 뉴런은 뒤늦게 깊숙이 거주하여 전기 생리학적 기록을 매우 어렵게 만듭니다. Zebrafish는 모델 유전 시스템이며, 우리의 전기 생리학 프로토콜은 응성 방전, 모발 세포 감도, 흥분 독성 등의 측면을 강력하게 조사하기 위해 형질 전환선에 의해 보완 될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

국립보건원(DC010809), 국립과학재단(IOS1257150, 1856237), 휘트니 해양생물과학연구소의 지원을 J.C.L에 감사드립니다. 랴오랩의 과거와 현 멤버들에게 토론을 자극해 주신 것에 대해 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL beaker PYREX 1000 resceptacle for etchant
10x water immersion objective Olympus UMPLFLN10xW low magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objective Olympus LUMPLFLN40XW higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.m supplemental coding file custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.m supplemental coding file custom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cables ThorLabs 2249-C-12 connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filament Warner Instruments G150F-3 inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computer N/A N/A any computer should work
DC Power Supply Tenma 72-420 used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Axon DigiData 1440A enables acquisition of patch-clamp data
filament Sutter Instrument Company FB255B 2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscope Olympus BX51WI microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tip Fisher Scientific 02-707-169 flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDish World Precision Instruments Inc. FD3510-100 cover glass bottomed dish recording dish
KimWipe KimTech 34155 task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-Gard World Precision Instruments Inc. 710172 self-mixing sylgard elastomer
MATLAB MathWorks R2020b command line software for preprocessing data
microelectrode amplifier Axon Instruments, Molecular Devices MultiClamp 700B patch clamp amplifier for dual channel recordings
microforge Narishige MF-830 microforge to polish recording electrode
micromanipulator control unit Siskiyou MC1000-eR/T 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97 for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unit Siskiyou MC1000e positions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulator Siskiyou MX7600 positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp Commander Molecular Devices 2.2.2 downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air table Newport Corporation VH3036W-OPT breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMP Molecular Devices 10.7.0 downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink marker Sharpie order from amazon.com for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dish Falcon 35-3001 used to immerse larvae in paralytic
pipette holder Molecular Devices 1-HL-U hold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducer Fluke Biomedical Instruments DPM1B for controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473-25G etchant for etching dissection pins
silicone tubing Tygon 14-169-1A tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000-C used to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor blade Canopus order from amazon.com cuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringe Becton Dickinson Compoany 309602 filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipette Sigma-Aldrich Z135003-500EA single use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonate Syndel 12854 pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wire World Precision Instruments Inc. 715500 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unit Sigma-Aldrich SCGVU11RE single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstage Molecular Devices CV-7B supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxin ThermoFisher B1601 for immobilizing the larvae prior to recording

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References

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신경 과학 문제 168 머리 세포 전기 생리학 복부 뿌리 efferent 사본 corollary 출력
얼룩말피에서 수영하는 동안 후방 측면 라인 발신 신경의 활동
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Lunsford, E. T., Liao, J. C.… More

Lunsford, E. T., Liao, J. C. Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish. J. Vis. Exp. (168), e62233, doi:10.3791/62233 (2021).

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