Aktivitet af Posterior Lateral Line Afferent Neuroner under svømning i zebrafisk

Afferente neuroner af mekanosensoriske systemer overfører information fra hårceller til hjernen under hørelse og balance. Elektrofysiologi kan afsløre følsomheden af afferente neuroner gennem direkte optagelser. Mens hele celle patching fra hårceller kan være udfordrende, registrering fra downstream afferent neuroner er lettere og giver mulighed for vurdering af handling potentialer som reaktion på kontrollerede stimulationer^1,2,3. Stimulerende hårceller fører til deres afbøjning, som ændrer mekanosensoriske strukturer, hvilket udløser en stigning i handlingspotentialer (pigge) i afferente neuroner^4,5,6. I mangel af eksterne stimuli spidser afferente neuroner også spontant på grund af glutamatlækage fra hårcellerne til afferente postsynaptiske terminaler^7,8, og har vist sig at bidrage til at opretholde følsomhed^9,10. Patch klemme registrering af afferent aktivitet gør det muligt observation af hår celle følsomhed og signal dynamik, der ikke er muligt ved hjælp af teknikker med lavere tidsmæssige opløsning, såsom i mikrofoni^11,12 eller funktionelle calcium imaging^13,14,15. Følgende protokol vil gøre det muligt at registrere afferent aktivitet samtidig med motoriske kommandoer til at afsløre øjeblikkelige ændringer i hår celle følsomhed.

Zebrafisk (Danio rerio) bruge hårceller indeholdt i neuromasts at komponere lateral linje system til at opdage vand bevægelse i forhold til deres krop, som er oversat til neurale signaler afgørende for navigation^16,17,^18,rovdyr undgåelse, bytte fange^19,20, og skolegang²¹. Vandgennemstrømningen kan også være selvgenereret af bevægelserne ved svømning^22,23,24, respiration^22,25,26og fodring²⁷. Disse adfærd omfatter gentagne bevægelser, der kan træthed hårceller og forringe sensing. Derfor er det afgørende, at det laterale linjesystem skelner mellem eksterne (exafferent) og selvgenererede (reafferent) flow stimuli. En naturlig følgeudladning dæmper selvgenererede strømningssignaler under bevægelse hos zebrafisk. Dette hæmmende prædiktivt motorsignal videresendes via faldende neuroner til de sensoriske receptorer for at ændre inputtet eller afbryde behandlingen af den reafferent feedback^28,29. Skelsættende arbejde, der bidrager til vores tidlige forståelse af dette feedforward-system, var afhængig af in vitro-præparater, hvor forbindelsen og den endogene aktivitet i det neurale kredsløb ikke blev opretholdt^{28,30,31,32,33,34,35}. Denne protokol beskriver en tilgang til at bevare et intakt neuralt kredsløb, hvor endogen feedbackdynamik opretholdes, hvilket muliggør bedre forståelse af den naturlige udledning in vivo.

Protokollen er skitseret her beskriver, hvordan man overvåger posterior lateral linje afferent neuron og motor neuron aktivitet samtidig i larve zebrafisk. Karakteriserer afferent signaldynamik før, under og efter motoriske kommandoer giver indsigt i realtid, endogen feedback fra centralnervesystemet, der modulerer hårcellefølsomhed under bevægelse. Denne protokol skitserer, hvilke materialer der skal udarbejdes forud for eksperimenter, og beskriver derefter, hvordan man lammer og forbereder zebrafisklarver. Protokollen vil beskrive, hvordan man etablerer en stabil løs patch optagelse af afferente neuroner og ekstracellulære ventral rod (VR) optagelser af motoriske neuroner. Repræsentative data, der kan fås ved hjælp af denne protokol, præsenteres fra en eksemplarisk person, og der blev udført analyse på flere replikater af forsøgsprotokollen. Forbehandling af data udføres ved hjælp af brugerdefinerede skrevne scripts i MATLAB. Samlet set er dette in vivo eksperimentelle paradigme klar til at give en bedre forståelse af sensorisk feedback under bevægelse i en model hvirveldyr hår celle system.

Al dyrepleje og forsøg blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af University of Florida's Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Fremstilling af materialer til elektrofysiologiske optagelser

1. Lav en silikone elastomerbundet optageskål.
   1. Dispenser et tyndt lag af selvblandende silikone elastomerkomponenter (f.eks. Sylgard) i en dækglasbundet vævskulturskål, indtil den niveauer med kanten af lavvandet godt. Ca. 0,5 mL er tilstrækkeligt.
   2. Dæk og hærde skålen i mindst 48 timer ved stuetemperatur.
2. Lav dissektionsnåle.
   1. Der skal gives en negativ ladning (5 V) til et 100 mL bægerglas med etchant (3M KOH) ved hjælp af en DC-strømforsyning, og fastgør en wolframtråd (0,002 tommer; 50,8 μm diameter) til den positivt ladede udgang.
      ADVARSEL: Negative og positive ledninger bør ikke kontakte hinanden under denne procedure, da du kan risikere at producere gnister, hvilket kan udgøre en potentiel brandfare.
   2. Etch wolframtråd ved hurtigt og gentagne gange at dyppe spidsen af ledningen i etchant badet, indtil spidsen indsnævres til et skarpt punkt. Under et stereomikroskop skæres ledningen ca. 1 mm fra spidsen med et barberblad med lige kant. Gentag tre gange mere, og indsæt derefter stifter i hærdet optageskål ved hjælp af fine pincet.
3. Gør optagelseselektroder klar.
   1. Træk et borosilikatglaskapillærrør (indvendig diameter: 0,86 mm, udvendig diameter: 1,50 mm) ved hjælp af en vandret mikropipettetrækker med kasseglødetråd i elektroder med en 30 μm diameterspids med let koniske (Figur 1 Ai), der vil blive brugt til at optage afferente neuroner fra den bageste sidelinje.
   2. Træk et ekstra borosilikatglaskapillærrør ind i et par elektroder med mindre spidsdiametre (1-5 μm). Hold en elektrode i hver hånd, kør forsigtigt spidserne over hinanden for at bryde dem til en ~ 30 ° vinkel. Brug en mikroforge, polere facet spids indtil glat. Den endelige spidsdiameter skal være mellem 30-50 μm og vil blive brugt som den ventrale rod (VR), der registrerer elektroden (Figur 1 Aii).
   3. Marker siden af VR-elektroden med forkanten med permanent blæk for at hjælpe med at orientere spidsens blænde nedad, når du indsætter elektroden i pipetteholderen på hovedbilledet (trin 3.2).
      BEMÆRK: Mekanisk modifikation af VR-indspilningselektroden er upræcis, og trin 1.3.2 kan kræve flere forsøg, indtil der opnås en passende spidsmorfologi inden polering. VR-optagelseselektrode er skrå for at overholde larvernes kropskurve. Når VR-optagelseselektroden er fremstillet, kan den bruges gentagne gange, så længe spidsen forbliver klar og ren mellem eksperimenterne.
4. Generer protokollen i elektrofysiologi optagelsesprogrammer.
   1. Sørg for, at det højre hovedbillede er forbundet med Kanal 1-indgangen bag på mikroelektronrostrodestrømmen og spændingsklemmeforstærkeren til de afferente neuronoptagelser, og at det venstre hovedbillede er forbundet med Kanal 2-indgangen til VR-optagelserne.
      BEMÆRK: Computerspecifikationer for strøm- og spændingsklemmeforstærkeren kræver minimalt 1 Ghz eller en bedre processor, Windows XP Pro eller Mac OS X 10.46.6, cd-rom-drev med 512 MB RAM, 500 MB harddiskplads og 2 USB-porte.
   2. Åbn den computerstyrede forstærkersoftware.
   3. Indstil Kanal 1 og Kanal 2 til aktuel klemmetilstand ved at klikke på IC-knappen for hver kanal.
   4. Indtast følgende parametre under både I-Clamp 1- og I-Clamp 2-fanerne . Primært output: 100x AC-membranpotentiale (100.000 mV/mV), forstærkning: 1.000, bessel: 1 kHz , AC: 300 Hz , Omfang: Bypass . Sekundær udgang: 100x AC Membran potentiale (100 mV/mV) , Gain: 1 , Lowpass Filter: 10 Hz.
   5. Gem kanalparametre som Ch1_Aff og Ch2_VR.
   6. Installer og åbn plasterklemmens elektrofysiologisoftware.
   7. Klik på Konfigurer og vælg Lab Bench for at indstille de analoge signaler ved at tilføje Ch1_Aff og Ch2_Vr til Digitizer Channels (f.eks Analog IN #0 og Analog IN #1), der er forbundet med BNC koaksialkabel til de tilsvarende Kanal 1 og Kanal 2 Skaleret Udgange af forstærkeren. Klik på OK.
      BEMÆRK: Minimumcomputerkravene til digitalisatoren er: en 1 Ghz- eller bedre processor, Windows XP Pro eller Mac OS X 10.46.6, cd-rom-drev 512 MB RAM, 500 MB harddiskplads og 2 USB-porte.
   8. Klik på Hent , og vælg Ny protokol.
   9. Vælg Gap Freeunder fanen Tilstand/hastighed . under Anskaffelsestilstandskal du indstille Prøvelængde til enten At bruge ledig diskplads (dvs. optage, indtil den er stoppet) eller et ønsket sæt Varighed (hh:mm:ss) og derefter indstille samplingfrekvensen pr. signal (Hz) til 20.000 for at maksimere opløsningen.
   10. Vælg de analoge IN-kanaler, der tidligere var konfigureret (i trin 1.4.6), under fanen Input, og vælg Ch1_Aff og Ch2_VR for den tilsvarende kanal.
   11. Vælg henholdsvis Cmd 0 og Cmd 1 for henholdsvis Kanal #0 og Kanal #1under fanen Output.
       1. Tilslut Kanal 1-kommandoen på forstærkeren til Analog Ouput 0 på digitalisatoren via BNC-koaksialkabel, og gentag for Kanal 2-kommandoen til analog udgang 1.
   12. De resterende faner kan forblive under standardindstillingerne. Klik på OK, og gem protokollen.

2. Forberedelse af opløsning

1. Forbered Hanks løsning: 137 mM NaCL, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na₂HPO_4,0,44 mM KH₂PO₄, 1,3 mM CaCl₂, 1,0 mM MgSO_4,4,2 mM NaHCO₄; pH-indtaling 7.3. Fortynd til 10% Hanks opløsning ved at tilsætte den passende mængde deioniseret vand til bestanden.
2. Forbered ekstracellulær opløsning: 134 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,2 mM MgCl_2,2,1 mM CaCl₂, 10 mM glukose, 10 mM HEPES buffer; pH 7,8 justeret med NaOH. Vakuumfilter ekstracellulær opløsning gennem filteret med 0,22 μm porestørrelse.
3. Forbered α-bungarotoxin: Opløs 1 mg lyofiliseret α-bungarotoxin i 10 ml ekstracellulær opløsning for at producere 0,1% fortynding.
4. Forbered Eutanasi løsning: 50% (mg / L) buffered farmaceutisk kvalitet MS-222 i 10% Hank's løsning.
   ADVARSEL: α-bungarotoxin er en potent neurotoksin, der lammer musklerne ved at blokere cholinrgiske receptorer. Handsker er påkrævet, og øjenværn anbefales under håndtering af lammende.

3. Forberedelse af larver til elektrofysiologiske optagelser

1. Immobilisere zebrafisk larver.
   1. Brug larver fra den laboratoriedyrkede population af zebrafisk (Danio rerio; 4-7 dage efter befrugtning) og hus i embryoopløsning (10% Hanks opløsning) ved 27 °C.
   2. Larven overføres fra huset til en lille petriskål (35 mm) ved hjælp af en storspidset overførselspipette, og så meget af den omgivende opløsning som muligt fjernes.
      BEMÆRK: Fjernelse af embryoopløsningen forhindrer fortynding af lammelsen og øger dens effektivitet. Hjørnet af en opgavetørring kan bruges til at transportere den resterende embryoopløsning væk, og det er vigtigt ikke at kontakte larverne eller lade larverne blive udsat for luft.
   3. Fordyb larver i 10 μL på 0,1% α-bungarotoxin i ca. 5 minutter.
      BEMÆRK: Den tid, der er nødvendig for at immobilisere larver, varierer mellem præparater. Et sundt præparat afhænger af nøje overvågning vedvarende hurtig blodgennemstrømning og nedsat motoriske reaktioner. Kort overeksponering for den paralytiske kan føre til et langsomt fald i den generelle sundhed af præparatet, selv efter en grundig udvaskning. Det er bedst at anvende en vask, før larven er helt immobiliseret, mens den stadig viser tegn på subtile muskelvibrationer.
   4. Vask lammet larve med ekstracellulær opløsning og bad i 10 minutter.
      BEMÆRK: Udvaskning giver larven mulighed for at skifte fra subtile muskelvibrationer til fuldstændig lammelse. Også α-bungarotoxin er en antagonist af den nikotin acetylkolin receptor (nAChR) α9-subunit, som er en kritisk komponent i den endogene feedback kredsløb denne protokol overholder; denne effekt har dog vist sig at være reversibel i Xenopus- og zebrafiskhårceller efter en 10 minutters udvaskning^36,29.
2. Pin fisk i optagelsen parabol.
   BEMÆRK: Anæstesi (f.eks. MS-222, Tricaine) er ikke påkrævet under tilberedning af larve zebrafisk (4-7 dpf), da det forstyrrer dyresundheden. Faktisk er larve zebrafisk undtaget fra visse hvirveldyr protokoller.
   1. Brug overførselspipette til at flytte larven fra det ekstracellulære opløsningsbad til den silikonebundede optageskål. Fyld resten af skålen med ekstracellulær opløsning.
   2. Under et stereomikroskop skal larverne forsigtigt placeres med finspidsede pincet over midten af silikonemåtten, sidesiden op, med kroppens forreste og bageste ender, der løber henholdsvis fra venstre mod højre. Derefter greb en ætset pin fra silikonemåtten ved hjælp af finspidsede pinde og indsæt stiften, ortogonisk til silikonen, gennem larvernes dorsale notochord direkte dorsal til anus. Den anden nål indsættes gennem notochordet nær enden af halen, og den tredje nål indsættes gennem gasblærens notochord-dorsale(figur 1B).
      BEMÆRK: Under indføring af stifter er det vigtigt at målrette mod midten af notochordbredden for at forhindre, at blodgennemstrømningen påvirker eller beskadiger den omgivende muskulatur. Den notochord er dorsal til den bageste laterale linje nerve, så med korrekt fastgørelse, ingen skade forventes at den laterale linje sensoriske neuroner. Indsæt efter første kontakt for ikke at forstyrre det omgivende væv. Ideelt set er diameteren af stiften mindre end halvdelen af bredden af notochord for at sikre ren indsættelse. Hvis stifterne overskrider denne bredde, skal du gentage trin 1.2, indtil den ønskede pinbredde er nået. Hvis blodgennemstrømningen aftager efter fastgørelse, gentages fra trin 1.3 og fremefter med en ny prøve.
   3. Den fjerde nål indsættes gennem otic vesikel, samtidig med at der opnås en let rotation mod den forreste del, når stiften indsættes i encapsulanten (Figur 1B). Som en lille rotation anvendes, se efter vævet mellem cleithrum og otic vesikel at afsløre klyngen af afferent somata.
      BEMÆRK: Vinklet indsættelse af den fjerde pin er at sikre eksponering af den bageste laterale linje afferent ganglion, som ellers er blokeret af den store otic vesikel.

4. Ventral rodoptagelse

1. Placer fastgjort larve under 10x vand nedsænkning mål på en fast fase differential interferens kontrast (DIC) oprejst mikroskop og orientere myseptal kløfter af muskelblokke parallelt med venstre headstage tilgang vektor (Figur 1B).
   1. Et fast stadie DIC-mikroskop, der flyder på et optisk luftbord, fungerer bedst for at forhindre vibrationer i at forstyrre optagelserne. Ved hjælp af en motoriseret positioner kan mikroskopet derefter bevæge sig frit rundt i det faste stadium, hvor præparatet og hovedscenerne er monteret (Figur 1C).
   2. Placer jordledningen i badeopløsningen, og sørg for, at den er forbundet til venstre hovedbillede.
2. Fyld VR-optagelseselektroden med 30 μL ekstracellulær opløsning ved hjælp af en fleksibel gel-loading pipettespids og sæt den ind i venstre headstage pipetteholder.
3. Sænk optagelsespipetten ned i parabolopløsningen med en mikromanipulator, mens du anvender positivt tryk (1-2 mmHg), der produceres af en pneumatisk transducer. Under 10x forstørrelse, bekræfte retningen af spidsen blænden vender nedad.
   1. Den pneumatiske transducer skal tilsluttes pipetteholderporten via silikonerør.
4. Placer VR-elektroden på myoseptumen
   1. Brug mikromanipulatoren igen, sænk VR-elektrodespidsen, indtil den holder position over larven. Forøg forstørrelsen til 40x nedsænkning.
   2. Bring elektroden spidsen over en myoseptum mellem to myomerer ventral til sidelinjen, indtil kløften er centreret i VR elektrode spids blænde(Figur 1D).
   3. Sænk pipetten, indtil spidsens bagudstudsendelse forsigtigt kommer i kontakt med epitelet. Efter indledende kontakt manøvreres pipetten diagonalt for at sikre, at forkanten kommer i kontakt og kan generere en forsegling.
   4. Påfør undertryk (~100 mm Hg) med den pneumatiske transducer og hold.
      BEMÆRK: Korrekt orientering af VR-pipetten i forhold til myoseptum og kontinuerligt undertryk optimerer detektering af motorneuronaktivitet med et højt signal-til-støj-forhold gennem huden.
5. Detektere motor neuron aktivitet.
   1. Det venstre hovedbillede skal tilsluttes forstærkeren, som videresender det forstærkede signal til en digitaliseringsenhed, der udsender det nævnte signal i plasterklemmens elektrofysiologisoftware, der skal overvåges på en tilstødende computer (se afsnit 1.4).
   2. I plasterklemmesoftwaren skal du klikke på knappen Afspil på værktøjsbjælken for at overvåge VR-signalet (Figur 1E).
   3. Sørg for, at VR-optagelsen opnås, når motorisk neuronaktivitet med velstereotype burst signaldynamik er observeret^29,37 (Figur 1E).
      BEMÆRK: Fictive svømmekampe er aktivitetsmønstrene for de VR-motoriske neuroner, der fortsætter med at sende på trods af, at præparatet er lammet. Derfor er fiktive svømmer et tilgængeligt middel til bestemmelse af dyrets adfærdsmæssige tilstand og måling af lokomotoriske parametre, mens de samtidig udfører afferente neuronoptagelser, der kræver et immobiliseret præparat. I vores hænder, når en VR-optagelse er opnået, vil en sund forberedelse fremkalde frivillige fiktive svømmekampe med få sekunders mellemrum. Husk, en sund forberedelse har vedvarende hurtig blodgennemstrømning. Det anbefales, at det kan tage flere minutter at opnå et tilstrækkeligt VR-signal, og signal-til-støj-forholdet kan forbedres efter den første detektion. Af hensyn til tiden er det acceptabelt at gå videre til afsnit 5.
   4. Hvis en VR-optagelse stadig ikke opnås efter endt afsnit 5, skal du udløse undertryk, hæve elektroden og gentage fra trin 4.4.2 og fremefter på en anden myoseptum, hvis larvens sundhed stadig er optimal.

5. Afferent neuron optagelse

1. Den afferente registreringselektrode fyldes med 30 μL ekstracellulær opløsning. skær i højre headstage pipetteholder (Figur 1B, C), og sænk ned i skålopløsningen, mens der påføres positivt tryk (1-2 mm Hg), der produceres af en pneumatisk transducer.
2. Find og løst knytte til bageste lateral linje afferent ganglion.
   1. Brug en mikromanipulator til at sænke den afferente elektrodespids, indtil den holder position over cleithrum.
   2. Forøg forstørrelsen til 40x nedsænkning og find skæringspunktet mellem den bageste sidelinje nerve og cleithrum. Følg den laterale linje nerve forreste fra cleithrum til, hvor fibrene innervate den bageste laterale linje afferent ganglion, skelnes af diskret klynge af soma (Figur 1F).
   3. Bring elektrodespidsen over den afferente ganglion og sænk pipetten, indtil spidsen kommer i kontakt med epitelet. Forsigtigt manøvrere elektroden, så hele spidsen omkreds kontakter afferente ganglion.
   4. Påfør undertryk (20-50 mm Hg) med den pneumatiske transducer og hold.
      BEMÆRK: Det undertryk, der påføres den afferente ganglion, er blidere end den suge, der påføres under ventralrodsregistreringen. Stigende undertryk kan forbedre signal-til-støj, men afferent neuron sundhed falder under vedvarende aggressiv sugning, hvilket reducerer sandsynligheden for en vellykket optagelse.
3. Optag afferent neuron aktivitet.
   1. Sørg for, at det rigtige hovedbillede er forbundet i en lignende rækkefølge som beskrevet i trin 4.5.1.
   2. I pClamp10 skal du klikke på knappen Afspil på værktøjsbjælken for at overvåge afferent neuron og VR-signal samtidigt.
   3. Sørg for, at hele cellen, løs patch optagelse af afferente neuroner er opnået, når pigge opstår spontant, omtrent hver 100-200 ms^1,29 (Figur 1E).
   4. Gradvist øge den afferente neuron registrering elektrode tryk tilbage til atmosfærisk (0 mm Hg) og hold for resten af optagelsen.

6. Erhvervelse af data

1. Samtidig optagelse.
   1. Når afferent neuron og motor neuron aktivitet er begge opdaget, skal du klikke på Record knappen på værktøjslinjen i pClamp10 at fange samtidige hulfri optagelser i begge kanaler.
   2. Post for den ønskede varighed (Figur 1E).
      BEMÆRK: En optagelse i et sundt præparat kan vare i mange timer og forblive lydhør over for eksterne stimuli.
   3. Gem optagelsen som en understøttet filtype (.abf, pClamp10) for at bevare metadata, f.eks.

7. Aktiv dødshjælp

1. Påfør positivt tryk (10 mm Hg) på både afferente og VR-optagelseselektroder ved hjælp af pneumatiske transducere og hæv elektroderne fra optageretten ved hjælp af mikromanipulatorerne.
2. Overfør optageretten fra DIC-mikroskopet med fast stadie til dissektionssterroskopet.
3. Ved hjælp af fine spids pinps, fjern wolfram stifter fra notochord og otic kapsel, og overføre larverne ved hjælp af en overførsel pipette i en Petri parabol (35 mm) indeholder 5 ml aktiv dødshjælp løsning i mindst 5 min.

8. Forbehandling og dataanalyse

BEMÆRK: Dataforbehandling og -analyse vil kræve en grundlæggende forståelse af kommandolinjekodning.

1. Konverter optagelsesfilen til forbehandling.
   1. Installer Matlab-softwaren.
   2. Hent det brugerdefinerede skrevne script, abfload.m^38, og gem filen i den samme mappe, hvor den rå optagelsesfil gemmes.
   3. Åbn abfload.m i vinduet Matlab Editor, og klik på Kør på værktøjslinjen. Vælg Skift mappe, hvis du bliver bedt om det.
   4. Udfør funktionen i kommandovinduet med den rå optagelsesfil som input,
      > [d,si,h] = abfload('[rå optagelse filnavn].abf')
      og gem outputarbejdsområdet med et filnavn, der indeholder larvebetegnelse, alder og forsøgsdato, f.eks.
      BEMÆRK: Det konverterede filnavn må kun indeholde understregningstegnsdetalere.
2. Udfør forbehandling af data.
   1. Hent Matlab-script AffVR_preprocess.m og tilknyttede funktioner, der er brugerdefineret skrevet af forfatterne.
   2. Åbn AffVR_preprocess.m i vinduet Redaktør.
   3. Under Variablerskal du justere tærsklerne for registrering af spidser på nedre grænse for både afferente og VR-optagelser(henholdsvis spk_detect_lb og vr_detect_lb, linje 8 og 14), afhængigt af registreringen af signal-til-støj-forholdet.
      BEMÆRK: Spike detektion er afhængig af manuel tærskel for at sortere og isolere signaler fra mere end én afferent neuron ved amplitude. Baseline støj og aktivitet fra andre enheder filtreres ud ved at tærskel for kun at omfatte spike amplituder inden for en procent (f.eks spk_detect_lb) af den maksimale (f.eks spk_detect_ub). Tærskelværdi sikrer også nøjagtig binning af motoriske aktivitet spikes i byger og kollektive fiktive svømme anfald. Generelt skal du starte med en tærskel nedre grænse på 0,5, og gradvist falde, indtil nøjagtig detektion er opnået. For eksempel vil indstilling spk_detect_lb som 0,5 og spk_detect_ub som 1,0 registrere alle pigge svarende til eller større end 50% af spike amplitude maksimum og udelukke støj eller yderligere neuroner af lavere spike amplituder (Figur 2A). Alternativt kunne man også sænke spk_detect_ub fra 1,0 for at udelukke neuroner af højere spike amplituder for at isolere neuronerne af lavere spike amplituder. Forbehandlingstaloutput (se trin 7.2.6) vil oplyse, om justeringer og gentagelse fra trin 7.2.2 er nødvendige.
   4. Klik på Kør i vinduet Editor for at udføre AffVR_preprocess.m.
   5. Gå til den tidligere konverterede .mat-datafil (se trin 7.1.3); vælg og klik på Åbn for at starte automatisk forbehandling.
      BEMÆRK: Mens det brugerdefinerede script kører, vises output i kommandovinduet, der informerer om dets fremskridt gennem behandlingstrin som "filtrering af data ...", "detektering af ventral rodaktivitet ..."og "generering af tal ...".
   6. Tal, der genereres af AffVR_preprocess.m, vil visualisere afferent spike og VR-detektion og angive, om analysevariabler skal justeres (Figur 2).
   7. Skriv "Y" på tastaturet for at gemme forudbehandlede metadata i en preprocess_output mappe.
   8. Forudbehandlede data udskrives automatisk som data_out.xls.
3. Analyser de forudbehandlede data efter behov.

Efter zebrafisk larver er korrekt immobiliseret og den bageste laterale linje afferent ganglion og VR optagelse er opnået, aktivitet i både afferent og motor neuroner kan måles samtidigt. Optagelseskanaler vises ved hjælp af gap-free optagelsesprotokoller (trin 1.4) til kontinuerlig overvågning af afferent- og VR-aktivitet. I realtid kan der observeres fald i spontan afferent spike rate samtidig med VR-aktivitet, der indikerer fiktive svømmekampe (figur 1E). Vi fandt ud af, at de bedste resultater og nøjagtig spike-detektion var produkter af optagelser, der opnåede et signal-til-støj-forhold på mindst 0,5. Brugerdefinerede skriftlige forbehandlingsscripts genererer plots, der hjælper med at visualisering af afferent- og VR-spike-detektion. Spontane afferente pigge identificeres ved hjælp af en kombination af spike parametre såsom tærskel, minimum varighed (0,01 ms), og minimum inter-spike interval (ISI; 1 ms). Stigende undertryk, samtidig med at optagelsen ofte giver signaldetektering fra flere afferente enheder på én gang. Filtrering ved amplitude gør det muligt at skelne mellem signaldynamik af uafhængige afferenter. Isolering af signaler kan opnås ved at justere de nedre og øvre bundne detektionsvariabler i forbehandlingsscriptet (Figur 2A). Aggressiv sugning for at opnå multi-enhed optagelser kan føre til ustabile optagelser, mekanisk støj, nedbrydning af afferent sundhed, og i sidste ende et tab af signal. Derfor er det vigtigt langsomt at skrue tilbage suge til atmosfærisk tryk, når det ønskede signal er opnået. Ventral rod spike detektion følger identiske parametre til afferent spike detektion, men kræver yderligere input til at definere forskellige fiktive svømme anfald. Bursts inden for en motorkommando defineres af VR-aktivitet med mindst to pigge inden for 0,1 ms fra hinanden og varede mindst 5 ms. Alle svømmekampe afgrænses derefter med mindst tre bursts med inter-burst intervaller på <200 ms (Figur 2B).

Afferent aktivitet er vanskelig at fortolke, når man ser på en optagelse i sin helhed. Forbehandlingsscripts vil overlejre dele af afferentaktivitet centreret om en veldefineret periode af interesse, i dette tilfælde starten af en svømmekamp (n = 33, Figur 2C) for at hjælpe med at visualisere tendenser i signaldynamik. Øjeblikkelig afferent aktivitet beregnes ved hjælp af et filter med glidende gennemsnit og et 100 ms prøvetagningsvindue. Gennemsnitlig spontan aktivitet viser dramatiske ændringer som reaktion på motoraktivitetens ind vedsætning(figur 2C). For bedre at dissekere og analysere afferent aktivitet, perioder før og efter svømme er indstillet til at matche tidsintervallet for den tilsvarende svømme bout. I forbehandlingsscriptet og de repræsentative analyserede resultater kaldes disse perioder "pre-swim" og "post-swim". Pre-swim, svømme, og post-svømme spike satser blev beregnet ved at tage antallet af pigge inden for den respektive periode i løbet af dens varighed. Præcisionen af estimater for hver enkelt er delvis en funktion af antallet af svømmer, så vi analyserede variable relationer ved hjælp af vægtede regressioner, med individuelle vægte svarende til kvadratroden af antallet af svømmer.

Forskelle i afferente spike satser på tværs af de forskellige perioder af interesse (pre-svømme, svømme, og post-svømme) blev testet af en to-vejs analyse af varians (ANOVA). Tukey's post-hoc test opdaget betydelige forskelle i spike satser mellem svømning spike satser og spike satser for både pre-swim (8,94 ± 0,2 Hz, relativt fald 57%) og efter svømmetur (5,34 ± 0,2 Hz, relativt fald 40%) Perioder. Spike sats ikke umiddelbart vende tilbage til baseline, da vi også konstateret, at post-svømme spike sats var lavere end pre-swim spike sats (Tukey post-hoc tests på tværs af grupper, p < 0,001; Figur 3A). Lineære modeller blev brugt til at opdage relationer mellem relativ spike sats og fiktive svømme parametre. Relativ spike sats blev beregnet ved at tage svømme spike sats over pre-svømme spike sats. Fiktive svømmeparametre omfattede svømmevarighed, svømmefrekvens (dvs. antal byger inden for en svømmekamp i løbet af svømmekampens varighed) og arbejdscyklus (dvs. summen af svømmeeksplosionens varighed over svømmekampens samlede varighed). I vores hænder var gennemsnit og varians af relativ spike rate korreleret, så det var nødvendigt for de data, der skal log omdannes til analyse. Afferent spike rate var negativt korreleret med svømme varighed betyder, at den laterale linje oplever større hæmning under svømmer af længere varighed (r² = 0,186, F_2,26 = 2,971, p = 0,045; Figur 3B). Der blev ikke påvist nogen korrelation mellem den relative stigningstakt og hverken svømmefrekvensen eller arbejdscyklussen ((r² = 0,099, F_2,26 = 1,431, p = 0,231 og^{r 2} = 0,047, F_2,26 = 0,645, p = henholdsvis 0,932; Figur 3C, D). Alle analyser af variable relationer blev vægtet med antallet af svømmeture pr. individ, og alle variablerne blev derefter gennemsnit af hver enkelt person (n = 29).

Figur 1:Samtidig elektrofysiologisk registrering af bageste sidelinjeafferente neuron- og ventralmotorrodsaktivitet. Eksempel på en løsplaster (i) og ventralmotorrod (ii) registrering af elektroder. Skalastænger repræsenterer 50 μm. (B) Larval zebrafisk er lammet og fastgjort fire steder (krydssymboler) til en Sylgard skål til registrering af stabilitet. Fed kryds repræsenterer indsættelsespunkter for stifter. (C) Elektrofysiologi riggen er monteret på en vibration-isolation bord og består af en opretstående fast stadie mikroskop på en motoriseret controller i stand til 40x forstørrelse. Dobbeltstrøms klemme og spændingsklemmehovedtrin er monteret på mikromanipulatorer. (D)Myomererne i kroppens muskulatur er adskilt af myosepta, der tjener som registrering af vartegn for motoriske neuron arborizations. Den ventrale motoriske rodelektrode nærmer sig ventralkroppen (til venstre) og er centreret og sænket oven på en myoseptum (pilespids). Skalabjælke repræsenterer 50 μm. (E) Skærmbillede af elektrofysiologisk optagelse i realtid, hvilket muliggør visualisering af den spontane afferente aktivitet (kanal 1) og sprængning af ventralrodsaktivitet, der indikerer fiktive svømmekampe (kanal 2). Knapperne Optag og Afspil er angivet med røde pile. (F) Den bageste laterale linje afferent ganglion (stiplede linje) ligger lige under huden og kan identificeres ved en stram klynge af afferent soma. Den ganglion kan være placeret ved at følge den laterale linje nerve forbi cleithrum knoglen (pilespids) til, hvor det forbinder til ganglion. Skalalinjen repræsenterer 30 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Forbehandling af figuroutput visualiserer nøjagtig registrering af pigge. (A)Ekstracellulær, løs-patch optagelse af bageste lateral linje afferent neuroner. Diskrete pigge (mærket med røde prikker) registreres med et interval på mindst 1 ms. Baseline støj og aktivitet fra andre enheder filtreres ud ved at tærsklen til kun at omfatte spike amplituder inden for 50% af maksimum. (B) Ventral motorrodsoptagelse (VR) af fiktive svømmekampe afslører frivillige motoriske kommandoer under hele optagelsen. VR-pigge (røde prikker) registreres ved hjælp af et lignende tærskelfilter og placeres derefter i en enkelt svømmekamp (grøn) ved at registrere en eksplosion af aktivitet inden for 200 ms fra hinanden (se indsæt; skalabjælke repræsenterer 200 ms). Pigge, der påvises uden for den definerede svømmekamp, forekommer ikke inden for inter-spike-intervallet af stereotype burst-aktiviteter og er derfor udelukket. (C) Gennemsnitlig spontan afferent spike rate centreret ved starten af hver svømme bout (tid = 0 s) illustrerer spike sats før, under og efter svømning. Fejllinjer repræsenterer ± SEM. Klik her for at få vist en større version af dette tal.

Figur 3: Kvantificeringen af afferent aktivitet før, under og efter fiktiv svømning. Statistisk lignende grupperinger er betegnet med a og b. (B) Længere svømmevarighed er korreleret med nedsat afferent spike rate. (C-D) Svømmefrekvens og svømmetidscyklus viser ingen sammenhæng med afferent spike-hastighed. Alle værdier repræsenterer middelværdi ± SEM. Fjerntliggende personer med lav statistisk vægt blev udeladt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Den beskrevne eksperimentelle protokol giver mulighed for at overvåge endogene ændringer i sensorisk input på tværs af motorisk adfærd i en intakt, barbering hvirveldyr. Specifikt beskriver den en in vivo-tilgang til udførelse af samtidige ekstracellulære optagelser af laterale linjeafferente neuroner og ventralmotoriske rødder i larve zebrafisk. Spontan afferent aktivitet har tidligere været karakteriseret ved zebrafisk uden hensyntagen til potentiel samtidig motoraktivitet^1,2,39,40,41. Uden at overvåge tilstedeværelsen af motorisk aktivitet med ventrale rodoptagelser vil dechifrering afferent aktivitet sandsynligvis blive undervurderet på grund af påvirkningen af brusende hæmning under og selv efter spontan svømning.

In vivo elektrofysiologiske optagelser er i sagens natur udfordrende. Det er vores erfaring, at opretholde en sund forberedelse er den største enkeltstående faktor for at opnå en vellykket, langvarige optagelser til afferente neuroner og ventral motoriske rødder. For at gøre dette er det vigtigt ikke kun at identificere og overvåge hurtig blodgennemstrømning, men også genkende teksturen af huden og den underliggende muskulatur. Vi anbefaler at observere flere lammede larver under et mikroskop før yderligere håndtering for at blive fortrolig med den iboende blodgennemstrømning og hudtilstand af sunde larver. En vellykket ventral rodregistrering gennem huden kræver en glat, sund hudoverflade, for at optagelseselektroden kan generere en tæt forsegling. Denne tilgang omgår traditionelle protokoller^37,42, der er invasive og tidskrævende, som opfordrer til dissekering væk epitelet for at afsløre den underliggende muskulatur. En ulempe ved at optage gennem huden er den potentielle variation i tide, før signalerne realiseres. Optimering af størrelsen og varigheden af det påførte undertryk vil reducere den tid, det tager at etablere et signal og potentielt forbedre signal-til-støj-forholdet. Optagelser fra et sundt, aktivt præparat bør give spontane afferente spike satser mellem 5-10 Hz med fiktive svømme anfald forekommer hvert par sekunder.

Ud over at afsløre motorisk aktivitetstilstand kan ventrale rodoptagelser fungere som en proxy for overvågning af brusende aktivitet, der udleder parallelt med motoriske kommandoer for at dæmpe sidelinjeaktivitet^30,31,32 samt aktivitet i homologe hårcellesystemer (f.eks. det auditive og vestibulære system^35,43,44,45). Sprudlende neuroner bor dybt i baghjernen, hvilket gør elektrofysiologiske optagelser af dem overordentlig udfordrende. Zebrafisk er et modelgenetisk system, og vores elektrofysiologiprotokol kan suppleres med transgene linjer for kraftigt at undersøge aspekter af naturlig udledning, hårcellefølsomhed, excitotoksicitet og videre.