Aktivität von posterioren Lateral Line Afferent Neuronen beim Schwimmen im Zebrafisch

Affente Neuronen mechanosensorischer Systeme übertragen während des Hörens und Gleichgewichts Informationen von Haarzellen an das Gehirn. Die Elektrophysiologie kann die Empfindlichkeit afferenter Neuronen durch direkte Aufnahmen aufdecken. Während das Patchen ganzer Zellen aus Haarzellen eine Herausforderung sein kann, ist die Aufzeichnung von nachgeschalteten afferenten Neuronen einfacher und ermöglicht die Beurteilung von Aktionspotentialen als Reaktion auf kontrollierte Stimulationen^1,2,3. Stimulierende Haarzellen führen zu ihrer Ablenkung, die mechanosensorische Strukturen verändert und so eine Zunahme der Aktionspotentiale (Spikes) in verschiedenen Neuronen^{auslöst 4,5,6}. In Abwesenheit äußerer Reize steigen afferent neuronen auch spontan aufgrund von Glutamatlecks aus den Haarzellen auf die afferenten postsynaptischen Terminals^7,8und tragen nachweislich zur Aufrechterhaltung der Empfindlichkeit bei^9,10. Die Patch-Clamp-Aufzeichnung der afferenten Aktivität ermöglicht die Beobachtung der Empfindlichkeit und Signaldynamik von Haarzellen, die mit Techniken mit geringerer zeitlicher Auflösung nicht möglich sind, wie z.B. in der Mikrophonik^11,12 oder funktionellen Calcium-Bildgebung^13,14,15. Das folgende Protokoll ermöglicht die Aufzeichnung afferenter Aktivität gleichzeitig mit motorischen Befehlen, um sofortige Veränderungen der Haarzellempfindlichkeit aufzudecken.

Zebrafische (Danio rerio) verwenden Haarzellen, die in Neuromasten enthalten sind, die das Seitenliniensystem bilden, um Wasserbewegungen relativ zu ihrem Körper zu erkennen, die in neuronale Signale übersetzt werden, die für die Navigation unerlässlich sind^16,17,18, Raubtiervermeidung, Beutefang^19,20und Schulung²¹. Der Wasserfluss kann auch durch die Bewegungen des Schwimmens^{22 , 23,24}, Atmung^{22 , 25,26}und Fütterung²⁷selbst erzeugt werden. Diese Verhaltensweisen umfassen sich wiederholende Bewegungen, die Haarzellen ermüden und die Wahrnehmung beeinträchtigen können. Daher ist es entscheidend, dass das Seitenliniensystem zwischen externen (exafferenten) und selbst erzeugten (reafferenten) Strömungsreizen unterscheidet. Eine Folgeentladung schwächt selbst erzeugte Strömungssignale während der Fortbewegung bei Zebrafischen ab. Dieses hemmende prädiktive motorische Signal wird über absteigende Neuronen an die sensorischen Rezeptoren weitergeleitet, um den Eingang zu modifizieren oder die Verarbeitung des reafferenten Feedbacks zu unterbrechen^28,29. Bahnbrechende Arbeiten, die zu unserem frühen Verständnis dieses Feedforward-Systems beitrugen, stützten sich auf In-vitro-Präparate, bei denen die Konnektivität und die endogene Aktivität des neuronalen Schaltkreises nicht aufrechterhalten wurden^28,30,31,^32,33,34,35. Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Erhaltung eines intakten neuronalen Schaltkreises, in dem die endogene Rückkopplungsdynamik aufrechterhalten wird, wodurch ein besseres Verständnis der Folgeentladung in vivo ermöglicht wird.

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt, wie die Aktivität von afferenten Neuronen und Motoneuronen in Larvenzebrafischen gleichzeitig überwacht werden kann. Die Charakterisierung der afferenten Signaldynamik vor, während und nach motorischen Befehlen liefert Einblicke in die endogene Rückkopplung des zentralen Nervensystems in Echtzeit, die die Empfindlichkeit der Haarzellen während der Fortbewegung moduliert. Dieses Protokoll beschreibt, welche Materialien vor Experimenten vorbereitet werden müssen und beschreibt dann, wie Zebrafischlarven gelähmt und vorbereitet werden können. Das Protokoll wird beschreiben, wie eine stabile lose Patch-Aufzeichnung von afferenten Neuronen und extrazellulären ventralen Wurzelaufnahmen (VR) von Motoneuronen erstellt werden kann. Repräsentative Daten, die mit diesem Protokoll gewonnen werden können, werden von einer beispielhaften Person präsentiert und die Analyse wurde an mehreren Replikaten des experimentellen Protokolls durchgeführt. Die Vorverarbeitung der Daten erfolgt mithilfe von benutzerdefinierten Skripten in MATLAB. Insgesamt ist dieses experimentelle In-vivo-Paradigma bereit, ein besseres Verständnis des sensorischen Feedbacks während der Fortbewegung in einem Modell-Wirbeltier-Haarzellsystem zu liefern.

Alle Tierpflege und -experimente wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Florida genehmigt wurden.

1. Vorbereitung von Materialien für elektrophysiologische Aufnahmen

1. Machen Sie eine Aufnahmeschale mit Silikonelastomerboden.
   1. Geben Sie eine dünne Schicht selbstmischendem Silikonelastomerkomponenten (z. B. Sylgard) in eine Gewebekulturschale mit Deckglasboden, bis sie mit dem Rand des flachen Brunnens auffliegt. Etwa 0,5 ml sind ausreichend.
   2. Decken Sie das Gericht ab und härten Sie es mindestens 48 h bei Raumtemperatur aus.
2. Machen Sie Dissektionsstifte.
   1. Stellen Sie eine negative Ladung (5 V) für ein 100-ml-Becherglas aus Ätzmittel (3M KOH) mit einem DC-Netzteil bereit und befestigen Sie einen Wolframdraht (0,002 Zoll; 50,8 μm Durchmesser) am positiv geladenen Ausgang.
      ACHTUNG: Negative und positive Drähte sollten während dieses Vorgangs nicht miteinander in Kontakt treten, da Sie Gefahr laufen, Funken zu erzeugen, die eine potenzielle Brandgefahr darstellen könnten.
   2. Ätzen Sie Wolframdraht, indem Sie schnell und wiederholt die Spitze des Drahtes in das Ätzbad tauchen, bis sich die Spitze zu einem scharfen Punkt verengt. Schneiden Sie unter einem Stereomikroskop den Draht etwa 1 mm von der Spitze entfernt mit einer rasiermesserscharfen Klinge mit gerader Kante. Wiederholen Sie dies noch drei weitere Male und setzen Sie dann die Stifte mit einer feinen Pinzette in die ausgehärtete Aufnahmeschale ein.
3. Bereiten Sie Aufnahmeelektroden vor.
   1. Ziehen Sie ein Kapillarrohr aus Borosilikatglas (Innendurchmesser: 0,86 mm, Außendurchmesser: 1,50 mm) mit einem horizontalen Mikropipettenzieher mit Kastenfilament in Elektroden mit einer Spitze mit einem Durchmesser von 30 μm und leichter Verjüngung(Abbildung 1 Ai),die verwendet werden, um affelinete Neuronen aus der hinteren Seitenlinie aufzunehmen.
   2. Ziehen Sie ein zusätzliches Kapillarrohr aus Borosilikatglas in ein Elektrodenpaar mit kleineren Spitzendurchmessern (1-5 μm). Halten Sie eine Elektrode in jeder Hand und führen Sie die Spitzen vorsichtig übereinander, um sie in einen Winkel von ~ 30 ° zu brechen. Polieren Sie die abgeschränkte Spitze mit einer Mikroschmiede, bis sie glatt ist. Der endgültige Spitzendurchmesser sollte zwischen 30-50 μm liegen und wird als ventrale Wurzel (VR) Aufzeichnungselektrode verwendet(Abbildung 1 Aii).
   3. Markieren Sie die Seite der VR-Elektrode mit der Vorderkante mit permanenter Tinte, um die Spitzenöffnung beim Einführen der Elektrode in den Pipettenhalter der Kopfbühne nach unten auszurichten (Schritt 3.2).
      HINWEIS: Die mechanische Modifikation der VR-Aufzeichnungselektrode ist ungenau und Schritt 1.3.2 kann mehrere Versuche erfordern, bis vor dem Polieren eine geeignete Spitzenmorphologie erreicht ist. Die VR-Aufzeichnungselektrode ist abgeschrägt, um sich der Körperkurve der Larven anzupassen. Einmal hergestellt, kann die VR-Aufzeichnungselektrode wiederholt verwendet werden, solange die Spitze zwischen den Experimenten klar und sauber bleibt.
4. Generieren Sie das Protokoll in elektrophysiologischen Aufzeichnungsprogrammen.
   1. Stellen Sie sicher, dass die rechte Kopfbühne mit dem Kanal 1-Eingang auf der Rückseite des Mikroelektrodenstrom- und Spannungsklemmenverstärkers für die afferenten Neuronenaufnahmen und die linke Kopfbühne mit dem Kanal 2-Eingang für die VR-Aufnahmen verbunden ist.
      HINWEIS: Computerspezifikationen für den Strom- und Spannungsklemmverstärker erfordern mindestens 1 GHz oder einen besseren Prozessor, Windows XP Pro oder Mac OS X 10.46.6, CD-ROM-Laufwerk mit 512 MB RAM, 500 MB Festplattenspeicher und 2 USB-Anschlüsse.
   2. Öffnen Sie die computergesteuerte Verstärkersoftware.
   3. Stellen Sie Kanal 1 und Kanal 2 auf den aktuellen Klemmmodus ein, indem Sie für jeden Kanal auf die IC-Taste klicken.
   4. Geben Sie die folgenden Parameter unter den Registerkarten I-Clamp 1 und I-Clamp 2 ein. Primärausgang: 100x AC Membranpotential (100.000 mV/mV), Verstärkung:1.000, Bessel:1 kHz , AC:300 Hz , Scope: Bypass . Sekundärausgang: 100x AC Membranpotential (100 mV/mV), Verstärkung:1 , Tiefpassfilter: 10 Hz.
   5. Speichern Sie kanalparameter als Ch1_Aff und Ch2_VR.
   6. Installieren und öffnen Sie die Patch clamp Elektrophysiologie-Software.
   7. Klicken Sie auf Konfigurieren und wählen Sie Lab Bench, um die analogen Signale einzurichten, indem Sie Ch1_Aff und Ch2_Vr zu Digitizer-Kanälen (z. B. Analog IN #0 und Analog IN #1) hinzufügen, die über ein BNC-Koaxialkabel mit den entsprechenden Kanal 1- und Kanal 2-Skalierten Ausgängen des Verstärkers verbunden sind. Klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Die Mindestcomputeranforderungen für den Digitizer sind: ein Prozessor mit 1 GHz oder höher, Windows XP Pro oder Mac OS X 10.46.6, CD-ROM-Laufwerk 512 MB RAM, 500 MB Festplattenspeicher und 2 USB-Anschlüsse.
   8. Klicken Sie auf Acquire und wählen Sie New Protocol.
   9. Wählen Sie auf der Registerkarte Modus/Rate die Option Lückenfreiaus. Legen Sie unter Aufnahmemodusdie Testlänge entweder auf Verfügbaren Speicherplatz verwenden (d. h. bis zum Anhalten aufzeichnen) oder eine gewünschte festgelegte Dauer (hh:mm:ss)fest, und legen Sie dann die Abtastrate pro Signal (Hz) auf 20.000 fest, um die Auflösung zu maximieren.
   10. Wählen Sie auf der Registerkarte Eingänge die zuvor konfigurierten analogen IN-Kanäle (in Schritt 1.4.6) und Ch1_Aff und Ch2_VR für den entsprechenden Kanal aus.
   11. Wählen Sie auf der Registerkarte Ausgänge die Option Cmd 0 bzw. Cmd 1 für Kanal #0 bzw. Kanal #1aus.
       1. Schließen Sie Den Kanal 1-Befehl am Verstärker über ein BNC-Koaxialkabel an den Analogausgang 0 am Digitizer an und wiederholen Sie für Kanal 2 Den Befehl zum Analogausgang 1.
   12. Die übrigen Registerkarten können unter den Standardeinstellungen verbleiben. Klicken Sie auf OK und speichern Sie das Protokoll.

2. Lösungsvorbereitung

1. Hanks Lösung vorbereiten: 137 mM NaCL, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na₂HPO_4,0,44 mM KH₂PO_4,1,3 mM CaCl_2,1,0 mM MgSO_4,4,2 mM NaHCO_4; pH 7,3. Verdünnen Sie Hanks Lösung auf 10%, indem Sie dem Schaft das entsprechende Volumen an entionisiertem Wasser hinzufügen.
2. Extrazelluläre Lösung vorbereiten: 134 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,2 mM MgCl_2,2,1 mM CaCl_2,10 mM Glukose, 10 mM HEPES-Puffer; pH 7,8 mit NaOH eingestellt. Vakuumfilter extrazelluläre Lösung durch den Filter mit 0,22 μm Porengröße.
3. Bereiten Sie α -Bungarotoxin vor: 1 mg lyophilisiertes α-Bungarotoxin in 10 ml extrazellulärer Lösung auflösen, um eine Verdünnung von 0,1% zu erzeugen.
4. Euthanasielösung zubereiten: 50% (mg / L) gepuffertes MS-222 in 10% iger Hank-Lösung.
   VORSICHT: α-Bungarotoxin ist ein starkes Neurotoxin, das die Muskeln lähmt, indem es cholinerge Rezeptoren blockiert. Handschuhe sind erforderlich und Augenschutz wird beim Umgang mit dem Gelähmten empfohlen.

3. Vorbereitung von Larven für elektrophysiologische Aufnahmen

1. Zebrafischlarven immobilisieren.
   1. Verwenden Sie Larven aus der laborgezüchteten Population von Zebrafischen (Danio rerio; 4-7 Tage nach der Befruchtung) und beherbergen Sie sie in Embryolösung (10% Hank-Lösung) bei 27 ° C.
   2. Die Larve aus dem Gehäuse in eine kleine Petrischale (35 mm) mit einer großen Transferpipette übertragen und so viel wie möglich von der umgebenden Lösung entfernen.
      HINWEIS: Die Entfernung der Embryolösung verhindert die Verdünnung des Gelähmten und erhöht seine Wirksamkeit. Die Ecke eines Aufgabentuchs kann verwendet werden, um die verbleibende Embryolösung wegzutransportieren, und es ist wichtig, die Larven nicht zu kontaktieren oder Larven der Luft ausgesetzt zu lassen.
   3. Tauchen Sie Larven in 10 μL 0,1% α-Bungarotoxin für ca. 5 min.
      HINWEIS: Die Zeit, die zur Immobilisierung von Larven erforderlich ist, variiert zwischen den Präparaten. Ein gesundes Präparat hängt von der genauen Überwachung eines anhaltend schnellen Blutflusses und einer verminderten motorischen Reaktion ab. Eine kurze Überexposition gegenüber dem Gelähmten kann auch nach einer gründlichen Auswaschung zu einem langsamen Rückgang der allgemeinen Gesundheit des Präparats führen. Es ist am besten, eine Wäsche aufzutragen, bevor die Larve vollständig immobilisiert ist, während sie noch Anzeichen von subtilen Muskelvibrationen zeigt.
   4. Gelähmte Larve mit extrazellulärer Lösung waschen und 10 min baden.
      HINWEIS: Die Auswaschung ermöglicht es der Larve, von subtilen Muskelvibrationen zu einer vollständigen Lähmung überzugehen. Außerdem ist α-Bungarotoxin ein Antagonist des nikotinischen Acetylcholinrezeptors (nAChR) α9-Untereinheit, der eine kritische Komponente des endogenen Rückkopplungskreislaufs ist, den dieses Protokoll beobachtet; Dieser Effekt hat sich jedoch in Xenopus- und Zebrafisch-Haarzellen nach einem 10-minütigen Auswaschen^{von 36,29}als reversibel erwiesen.
2. Stecken Sie Fisch in die Aufnahmeschale.
   HINWEIS: Eine Anästhesie (z. B. MS-222, Tricain) ist bei der Vorbereitung von Larvenzebrafischen (4-7 dpf) nicht erforderlich, da sie die Tiergesundheit beeinträchtigen. Tatsächlich sind Zebralarvenfische von bestimmten Wirbeltierprotokollen ausgenommen.
   1. Bewegen Sie die Larve mit einer Transferpipette aus dem extrazellulären Lösungsbad in die Silikonboden-Aufnahmeschale. Füllen Sie den Rest der Schüssel mit extrazellulärer Lösung.
   2. Positionieren Sie die Larven unter einem Stereomikroskop vorsichtig mit einer feinspitzigen Zette über der Mitte der Silikonmatte, seitlich nach oben, wobei das vordere und hintere Ende des Körpers von links nach rechts verläuft. Greifen Sie dann mit einer feinspitzigen Pinge einen geätzten Stift von der Silikonmatte und führen Sie den Stift orthogonal zum Silikon durch das dorsale Notochord der Larven direkt dorsal zum Anus ein. Führen Sie den zweiten Stift durch das Notochord in der Nähe des Schwanzendes ein und führen Sie den dritten Stift durch den Notochord dorsal der Gasblase ein (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Beim Einsetzen von Stiften ist es wichtig, auf die Mitte der Notochordbreite zu zielen, um zu verhindern, dass der Blutfluss beeinträchtigt oder die umgebende Muskulatur beschädigt wird. Das Notochord ist dorsal zum Nervus lateralioris, so dass bei richtiger Fixierung keine Schädigung der sensorischen Neuronen der Seitenlinie zu erwarten ist. Nach dem ersten Kontakt einsetzen, um das umliegende Gewebe nicht zu stören. Im Idealfall beträgt der Durchmesser des Stiftes weniger als die Hälfte der Breite des Notochords, um ein sauberes Einsetzen zu gewährleisten. Wenn die Pins diese Breite überschreiten, wiederholen Sie Schritt 1.2, bis die gewünschte Pinbreite erreicht ist. Wenn sich der Blutfluss nach dem Anheften verlangsamt, wiederholen Sie Schritt 1.3 mit einer neuen Probe.
   3. Setzen Sie den vierten Pin durch das otische Vesikel ein, während Sie eine leichte Drehung in Richtung des vorderen Pins bereitstellen, wenn der Pin in die Verkapselung einführt (Abbildung 1B). Wenn eine leichte Rotation angewendet wird, achten Sie auf das Gewebe zwischen dem Cleithrum und dem otischen Vesikel, um die Ansammlung von afferenten Somata freizulegen.
      HINWEIS: Das abgewinkelte Einsetzen des vierten Stifts soll die Exposition des hinteren lateralen Linien-Afferenten-Ganglions gewährleisten, das ansonsten durch das große otische Vesikel behindert wird.

4. Ventrale Wurzelaufzeichnung

1. Legen Sie die gepinnte Larve unter das 10-fache Wasserimmersionsobjektiv auf ein DIC-Mikroskop (Differential Interference Contrast) mit fester Stufe und richten Sie die myseptalen Spalten der Muskelblöcke parallel zum linken Headstage-Annäherungsvektor aus (Abbildung 1B).
   1. Ein feststufiges DIC-Mikroskop, das auf einem optischen Lufttisch schwebt, verhindert am besten, dass Vibrationen die Aufnahmen stören. Mit einem motorisierten Positionierer kann sich das Mikroskop dann frei um die feste Stufe bewegen, in der die Vorbereitung und die Kopfbühnen montiert sind (Abbildung 1C).
   2. Legen Sie den Erdungsdraht in die Badlösung und stellen Sie sicher, dass er mit dem linken Kopfboden verbunden ist.
2. Füllen Sie die VR-Aufnahmeelektrode mit 30 μL extrazellulärer Lösung unter Verwendung einer flexiblen Gel-Loading-Pipettenspitze und führen Sie sie in den linken Pipettenhalter des Kopfstages ein.
3. Senken Sie die Aufzeichnungspipette mit einem Mikromanipulator in die Schalenlösung, während Sie einen positiven Druck (1-2 mmHg) ausüben, der von einem pneumatischen Wandler erzeugt wird. Vergewissern Sie sich bei 10-facher Vergrößerung, dass die Ausrichtung der Spitzenöffnung nach unten zeigt.
   1. Der pneumatische Wandler sollte über Silikonschläuche mit dem Pipettenhalteranschluss verbunden werden.
4. Legen Sie die VR-Elektrode auf das Myoseptum
   1. Verwenden Sie den Mikromanipulator erneut, senken Sie die VR-Elektrodenspitze, bis sie die Position über der Larve hält. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf 40-fache Immersion.
   2. Bringen Sie die Elektrodenspitze über ein Myoseptum zwischen zwei Myomeren ventral zur Seitenlinie, bis der Spalt in der VR-Elektrodenspitzenöffnung zentriert ist (Abbildung 1D).
   3. Senken Sie die Pipette, bis die verzögerte Kante der Spitzenöffnung sanft mit dem Epithel in Kontakt steht. Manövrieren Sie die Pipette nach dem ersten Kontakt diagonal, um sicherzustellen, dass die Vorderkante Kontakt herstellt und eine Dichtung erzeugen kann.
   4. Unterdruck (~100 mm Hg) mit dem pneumatischen Wandler ausüben und halten.
      HINWEIS: Die richtige Ausrichtung der VR-Pipette relativ zum Myoseptum und der kontinuierliche Unterdruck optimieren die Erkennung der Motoneuronaktivität mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis durch die Haut.
5. Erkennen Sie die Aktivität von Motoneuronen.
   1. Die linke Kopfbühne sollte an den Verstärker angeschlossen werden, der das verstärkte Signal an einen Digitizer weiterleitet, der das besagte Signal in die Patch clamp Elektrophysiologie-Software ausgibt, die auf einem benachbarten Computer überwacht werden soll (siehe Abschnitt 1.4).
   2. Klicken Sie in der Patch-Clamp-Software auf die Play-Taste in der Symbolleiste, um das VR-Signal zu überwachen (Abbildung 1E).
   3. Stellen Sie sicher, dass die VR-Aufzeichnung erreicht wird, sobald die Motoneuronaktivität mit gut stereotyper Burst-Signaldynamik beobachtet wird^29,37 (Abbildung 1E).
      HINWEIS: Fiktive Schwimmkämpfe sind die Aktivitätsmuster der VR-Motoneuronen, die trotz gelähmter Präparate weiter übertragen werden. Daher sind fiktive Schwimmen ein zugängliches Mittel, um den Verhaltenszustand des Tieres zu bestimmen und bewegungsmotorische Parameter zu messen und gleichzeitig afferent neuronente Aufnahmen durchzuführen, die eine immobilisierte Vorbereitung erfordern. In unseren Händen wird eine gesunde Vorbereitung, sobald eine VR-Aufnahme erreicht ist, alle paar Sekunden freiwillige fiktive Schwimmkämpfe hervorrufen. Denken Sie daran, dass ein gesundes Präparat einen schnellen Blutfluss aufrechterhalten hat. Beachten Sie, dass die Erzielung eines ausreichenden VR-Signals mehrere Minuten dauern kann und sich das Signal-Rausch-Verhältnis nach der ersten Erkennung verbessern kann. Im Interesse der Zeit ist es akzeptabel, zu Abschnitt 5 überzugehen.
   4. Wenn nach Abschluss von Abschnitt 5 immer noch keine VR-Aufnahme erreicht wird, lassen Sie den Unterdruck los, heben Sie die Elektrode an und wiederholen Sie ab Schritt 4.4.2 auf einem anderen Myoseptum, wenn die Larvengesundheit noch optimal ist.

5. Afferente Neuronenaufnahme

1. Füllen Sie die afferenten Aufzeichnungselektrode mit 30 μL extrazellulärer Lösung; In den rechten Pipettenhalter(Abbildung 1B,C)und unter Anwendung eines über einen pneumatischen Wandlers erzeugten Überdruck (1-2 mm Hg) in die Schüssellösung einlegen.
2. Lokalisieren und lose an einem hinteren lateralen Linienafferenten Ganglion befestigen.
   1. Senken Sie mit einem Mikromanipulator die afferentielle Elektrodenspitze ab, bis sie die Position über dem Cleithrum hält.
   2. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf 40-fache Immersion und lokalisieren Sie den Schnittpunkt des hinteren Seitenliniennervs und des Cleithrums. Folgen Sie dem Nervus lateral line anterior vom Cleithrum bis zu dem Ort, an dem die Fasern das hintere lateral line afferente Ganglion innervieren, erkennbar durch den diskreten Cluster von Soma (Abbildung 1F).
   3. Bringen Sie die Elektrodenspitze über das afferenten Ganglion und senken Sie die Pipette, bis die Spitze das Epithel kontaktiert. Manövrieren Sie die Elektrode vorsichtig so, dass der gesamte Spitzenumfang das affente Ganglion kontaktiert.
   4. Unterdruck (20-50 mm Hg) mit dem pneumatischen Wandler ausüben und halten.
      HINWEIS: Der Unterdruck, der auf das affente Ganglion ausgeübt wird, ist sanfter als der Saugdruck, der während der ventralen Wurzelaufzeichnung angewendet wird. Steigender Unterdruck kann das Signal-zu-Rauschen verbessern, aber die Gesundheit der afferenten Neuronen nimmt unter anhaltender aggressiver Absaugung ab, was die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Aufnahme verringert.
3. Zeichnen Sie die affente Neuronenaktivität auf.
   1. Stellen Sie sicher, dass die richtige Kopfbühne in einer ähnlichen Reihenfolge wie in Schritt 4.5.1 beschrieben verbunden ist.
   2. Klicken Sie in pClamp10 auf die Schaltfläche Wiedergabe in der Symbolleiste, um verschiedene Neuronen und VR-Signale gleichzeitig zu überwachen.
   3. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Zelle, lose Patch-Aufzeichnung von afferenten Neuronen erreicht wird, sobald Spikes spontan auftreten, ungefähr alle 100-200 ms^1,29 (Abbildung 1E).
   4. Erhöhen Sie allmählich den afferenten Neuronen-Aufzeichnungselektrodendruck wieder auf atmosphärisch (0 mm Hg) und halten Sie für den Rest der Aufnahme.

6. Datenerfassung

1. Gleichzeitige Aufzeichnung.
   1. Sobald sowohl die Aktivität unterschiedlicher Neuronen als auch der Motoneuronen erkannt wurde, klicken Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen in der Symbolleiste in pClamp10, um gleichzeitig lückenlose Aufnahmen in beiden Kanälen aufzunehmen.
   2. Aufzeichnung für die gewünschte Dauer (Abbildung 1E).
      HINWEIS: Eine Aufnahme in einem gesunden Präparat kann viele Stunden dauern und auf äußere Reize reagieren.
   3. Speichern Sie die Aufzeichnung als unterstützten Dateityp (.abf, pClamp10), um Metadaten wie Erfassungsparameter beizubehalten.

7. Euthanasie

1. Wenden Sie mit pneumatischen Wandlern einen Überdruck (10 mm Hg) auf affeniederte und VR-Aufzeichnungselektroden an und heben Sie die Elektroden mit den Mikromanipulatoren aus der Aufnahmeschale an.
2. Übertragen Sie die Aufnahmeschale vom feststehenden DIC-Mikroskop auf das Sezierstereomikroskop.
3. Entfernen Sie mit einer feinen Spitzenzette Wolframstifte aus Notochord und Otic-Kapsel und übertragen Sie die Larven mit einer Transferpipette in eine Petrischale (35 mm), die mindestens 5 ml Euthanasielösung für mindestens 5 Minuten enthält.

8. Vorverarbeitung und Datenanalyse

HINWEIS: Die Datenvorverarbeitung und -analyse erfordert ein grundlegendes Verständnis der Befehlszeilencodierung.

1. Konvertieren Sie die Aufnahmedatei für die Vorverarbeitung.
   1. Installieren Sie die Matlab-Software.
   2. Laden Sie das benutzerdefinierte Skript abfload.m³⁸ herunter und speichern Sie die Datei in demselben Ordner, in dem die Rohaufzeichnungsdatei gespeichert ist.
   3. Öffnen Sie im Matlab Editor-Fenster abfload.m und klicken Sie in der Symbolleiste auf Ausführen. Wählen Sie Ordner ändernaus, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
   4. Führen Sie die Funktion im Befehlsfenster mit der rohen Aufzeichnungsdatei als Eingabe aus,
      > [d,si,h] = abfload('[Name der Rohaufzeichnungsdatei].abf')
      und speichern Sie den Ausgabearbeitsbereich mit einem Dateinamen, der Larvenbezeichnung, Alter und Versuchsdatum enthält, z. B. [Probennummer]_[Alter in dpf]_[Name der rohen Aufzeichnungsdatei (standardmäßig auch experimentelles Datum enthalten)].
      HINWEIS: Der konvertierte Dateiname sollte nur unterStrichen abgegrenzte ganze Zahlen enthalten.
2. Führen Sie eine Datenvorverarbeitung durch.
   1. Laden Sie das Matlab-Skript herunter AffVR_preprocess.m und zugehörigen Funktionen, die von den Autoren speziell geschrieben wurden.
   2. Öffnen Sie im Fenster Editor AffVR_preprocess.m.
   3. Passen Sie unter Variablendie Schwellenwerte für die Erkennung von Untergrenzen für Spitzen sowohl für affente als auch für VR-Aufnahmen(spk_detect_lb und vr_detect_lb,Zeilen 8 bzw. 14) in Abhängigkeit von der Aufzeichnung des Signal-Rausch-Verhältnisses an.
      HINWEIS: Die Spike-Erkennung beruht auf manuellen Schwellenwerten, um Signale von mehr als einem afferenten Neuron nach Amplitude zu sortieren und zu isolieren. Baseline-Rauschen und Aktivität von anderen Einheiten werden durch Schwellenwerte herausgefiltert, um nur Spitzenamplituden innerhalb eines Prozents (z. B. spk_detect_lb) des Maximums (z. B. spk_detect_ub) einzubeziehen. Thresholding sorgt auch für ein genaues Binning von motorischen Aktivitätsspitzen in Bursts und kollektive fiktive Schwimmkämpfe. Beginnen Sie im Allgemeinen mit einer Schwellenwert-Untergrenze von 0,5 und verringern Sie allmählich, bis eine genaue Erkennung erreicht ist. Wenn Sie beispielsweise spk_detect_lb auf 0,5 und spk_detect_ub auf 1,0 einstellen, werden alle Spitzen erkannt, die mindestens 50 % des Spitzenamplitudenmaximums entsprechen und Rauschen oder zusätzliche Neuronen mit niedrigeren Spitzenamplituden ausschließen (Abbildung 2A). Alternativ könnte man auch die spk_detect_ub von 1,0 senken, um Neuronen mit höheren Spike-Amplituden auszuschließen, um die Neuronen niedrigerer Spike-Amplituden zu isolieren. Die Vorverarbeitung der Figurenausgaben (siehe Schritt 7.2.6) informiert darüber, ob Anpassungen und Wiederholungen aus Schritt 7.2.2 erforderlich sind.
   4. Klicken Sie im Editorfenster auf Ausführen, um AffVR_preprocess.m auszuführen.
   5. Navigieren Sie zur zuvor konvertierten .mat-Datendatei (siehe Schritt 7.1.3); Wählen Sie aus und klicken Sie auf Öffnen, um die automatische Vorverarbeitung zu starten.
      HINWEIS: Während das benutzerdefinierte Skript ausgeführt wird, werden im Befehlsfenster Ausgaben angezeigt, die den Fortschritt durch Verarbeitungsschritte wie "Filtern von Daten ...", "Erkennen ventraler Wurzelaktivität ..." und "Generieren von Zahlen ..." informieren.
   6. Die von AffVR_preprocess.m generierten Zahlen visualisieren die Erkennung von afferenten Spitzen und VR und zeigen an, ob Analysevariablen angepasst werden sollten (Abbildung 2).
   7. Geben Sie "Y" auf der Tastatur ein, um vorverarbeitete Metadaten in einem preprocess_output Ordner zu speichern.
   8. Vorverarbeitete Daten werden automatisch wie data_out.xlsausgegeben.
3. Analysieren Sie die vorverarbeiteten Daten wie gewünscht.

Nachdem Zebrafischlarven richtig immobilisiert und die hintere Seitenlinie afferentes Ganglion und VR-Aufzeichnung erreicht wurde, kann die Aktivität sowohl in afferenten als auch in Motoneuronen gleichzeitig gemessen werden. Die Anzeige der Aufzeichnungskanäle über lückenlose Aufzeichnungsprotokolle (Schritt 1.4) zur kontinuierlichen Überwachung der Afferent- und VR-Aktivität. In Echtzeit kann gleichzeitig mit der VR-Aktivität, die auf fiktive Schwimmkämpfe hinweist, eine Abnahme der spontanen afferenten Spitzenrate beobachtet werden (Abbildung 1E). Wir fanden heraus, dass die besten Ergebnisse und die genaue Spike-Erkennung Produkte von Aufnahmen waren, die ein Signal-Rausch-Verhältnis von mindestens 0,5 erreichten. Benutzerdefinierte Vorverarbeitungsskripte generieren Diagramme, um die Visualisierung der Afferent- und VR-Spike-Erkennung zu unterstützen. Spontane afferenten Spikes werden mit einer Kombination von Spike-Parametern wie Schwellenwert, Mindestdauer (0,01 ms) und minimalem Inter-Spike-Intervall (ISI; 1 ms) identifiziert. Die Erhöhung des Unterdrucks während der Aufzeichnung führt häufig zu einer Signalerkennung von mehreren afferenten Einheiten gleichzeitig. Die Filterung nach Amplitude ermöglicht die Unterscheidung zwischen der Signaldynamik unabhängiger Afferenten. Die Isolierung von Signalen kann durch Anpassung der Erkennungsvariablen unter- und oberhalbgrenzen im Vorverarbeitungsskript erreicht werden (Abbildung 2A). Aggressives Absaugen, um Aufnahmen mit mehreren Einheiten zu erreichen, kann zu instabilen Aufnahmen, mechanischem Rauschen, Verschlechterung der afferenten Gesundheit und letztendlich zu einem Signalverlust führen. Daher ist es wichtig, die Absaugung langsam auf atmosphärischen Druck zurückzurufen, sobald das gewünschte Signal erreicht ist. Die ventrale Wurzelspike-Erkennung folgt identischen Parametern wie die Afferent-Spike-Erkennung, erfordert jedoch zusätzliche Eingaben, um unterschiedliche fiktive Schwimmkämpfe zu definieren. Bursts innerhalb eines Motorbefehls werden durch VR-Aktivität mit mindestens zwei Spikes innerhalb von 0,1 ms voneinander definiert und dauerten mindestens 5 ms. Alle Schwimmkämpfe werden dann durch mindestens drei Bursts mit Inter-Burst-Intervallen von <200 ms abgegrenzen(Abbildung 2B).

Affe affente Aktivität ist schwer zu interpretieren, wenn man eine Aufnahme in ihrer Gesamtheit betrachtet. Vorverarbeitungsskripte überlagern Abschnitte afferenter Aktivitäten, die sich auf eine genau definierte Periode von Interesse konzentrieren, in diesem Fall den Beginn eines Schwimmkampfes (n = 33, Abbildung 2C),um Trends in der Signaldynamik zu visualisieren. Die momentane affe affe affe ente Aktivität wird mit einem Filter für den gleitenden Durchschnitt und einem 100-ms-Stichprobenfenster berechnet. Die mittlere spontane Aktivität zeigt dramatische Veränderungen als Reaktion auf den Beginn der motorischen Aktivität (Abbildung 2C). Um die affekte Aktivität besser zu sezieren und zu analysieren, werden die Perioden vor und nach dem Schwimmen so eingestellt, dass sie dem Zeitintervall des entsprechenden Schwimmkampfes entsprechen. Im Vorverarbeitungsskript und den repräsentativ analysierten Ergebnissen werden diese Perioden als "Pre-Swim" und "Post-Swim" bezeichnet. Die Spike-Raten vor dem Schwimmen, Schwimmen und nach dem Schwimmen wurden berechnet, indem die Anzahl der Spitzen innerhalb des jeweiligen Zeitraums über seine Dauer genommen wurde. Die Genauigkeit der Schätzungen für jedes Individuum ist teilweise eine Funktion der Anzahl der Schwimmen, daher haben wir variablen Beziehungen mit gewichteten Regressionen analysiert, wobei die einzelnen Gewichte gleich der Quadratwurzel der Anzahl der Schwimmen sind.

Unterschiede in den afferenten Spitzenraten in den verschiedenen interessierenden Perioden (vor dem Schwimmen, Schwimmen und nach dem Schwimmen) wurden durch eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) getestet. Tukeys Post-hoc-Test entdeckte signifikante Unterschiede in den Spike-Raten zwischen Schwimmen Spike-Raten und Spike-Raten sowohl vor dem Schwimmen (8,94 ± 0,2 Hz, relative Abnahme 57%) und nach dem Schwimmen (5,34 ± 0,2 Hz, relative Abnahme 40%) Perioden. Die Spike-Rate kehrte nicht sofort zum Ausgangswert zurück, da wir auch feststellten, dass die Spike-Rate nach dem Schwimmen niedriger war als die Spike-Rate vor dem Schwimmen (Tukey-Post-hoc-Tests über Gruppen hinweg, p < 0,001; Abbildung 3A). Lineare Modelle wurden verwendet, um Beziehungen zwischen relativer Spike-Rate und fiktiven Schwimmparametern zu erkennen. Die relative Spike-Rate wurde berechnet, indem die Swim-Spike-Rate über die Pre-Swim-Spike-Rate genommen wurde. Zu den fiktiven Schwimmparametern gehörten die Schwimmdauer, die Schwimmfrequenz (d. h. die Anzahl der Ausbrüche innerhalb eines Schwimmkampfes über die Dauer des Schwimmkampfes) und das Duty Cycle (d. h. die Summe der Schwimmausbruchdauer über die Gesamtdauer des Schwimmkampfes). In unseren Händen waren der Mittelwert und die Varianz der relativen Spitzenrate korreliert, so dass es notwendig war, dass die Daten für die Analyse protokolliert wurden. Die afferenten Spike-Rate war negativ mit der Schwimmdauer korreliert, was bedeutet, dass die Seitenlinie bei Schwimmen von längerer Dauer eine größere Hemmung erfährt (r² = 0,186, F_2,26 = 2,971, p = 0,045; Abbildung 3B). Es wurde keine Korrelation zwischen der relativen Spitzenrate und weder der Schwimmfrequenz noch dem Tastverhältnis festgestellt ((r² = 0,099, F_2,26 = 1,431, p = 0,231 und r² = 0,047, F_2,26 = 0,645, p = 0,932; Abbildung 3C, D). Alle Analysen von Variablenbeziehungen wurden mit der Anzahl der Schwimmen pro Individuum gewichtet und alle Variablen wurden dann von jedem Individuum gemittelt (n = 29).

Abbildung 1: Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung der afferenten Neuronen der hinteren Laterallinie und der ventralen motorischen Wurzelaktivität. (A). Beispiel für eine lose Pflaster-affefferente (i) und ventrale motorische Wurzel (ii) Aufzeichnungselektroden. Scale Bars stellen 50 μm dar. (B) Larvenzebrafische werden gelähmt und an vier Stellen (Kreuzsymbole) an eine Sylgard-Schale gepinnt, um die Stabilität aufzuzeichnen. Fett gedruckte Kreuze stellen Einfügepunkte für Stifte dar. (C) Das Elektrophysiologie-Rig ist auf einem Schwingungsisolationstisch montiert und besteht aus einem aufrechten Mikroskop mit fester Stufe auf einer motorisierten Steuerung, die eine 40-fache Vergrößerung ermöglicht. Doppelstromklemmen- und Spannungsklemmkopfstufen sind auf Mikromanipulatoren montiert. (D) Die Myomere der Körpermuskulatur werden durch Myosepta getrennt, die als Aufzeichnungspunkte für Motoneuron-Arborisationen dienen. Die ventrale motorische Wurzelelektrode nähert sich dem Ventralkörper (links) und wird auf einem Myoseptum (Pfeilspitze) zentriert und abgesenkt. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar. (E) Bildschirmaufnahme der elektrophysiologischen Aufzeichnung in Echtzeit ermöglicht die Visualisierung der spontanen afferenten Aktivität (Kanal 1) und der platzenden ventralen Wurzelaktivität, die auf einen fiktiven Schwimmkampf (Kanal 2) hinweist. Die Schaltflächen "Aufnehmen" und "Wiedergabe" sind mit roten Pfeilen gekennzeichnet. (F) Das hintere afferente Ganglion der Seitenlinie (gestrichelte Linie) liegt direkt unter der Haut und kann durch eine enge Ansammlung von afferentem Soma identifiziert werden. Das Ganglion kann lokalisiert werden, indem man dem Nervus lateral line vorbei am Cleithrum-Knochen (Pfeilspitze) folgt, wo es sich mit dem Ganglion verbindet. Der Maßstabsbalken stellt 30 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2:Vorverarbeitungs-Figurenausgänge visualisieren eine genaue Spike-Erkennung. (A) Extrazelluläre, lose Pflasteraufnahme von posteriolären lateralen Line afferenten Neuronen. Diskrete Spikes (mit roten Punkten beschriftet) werden mit einem minimalen Inter-Spike-Intervall von 1 ms erkannt. Baseline-Rauschen und -Aktivität von anderen Einheiten werden durch Schwellenwerte herausgefiltert, um nur Spitzenamplituden innerhalb von 50% des Maximums einzubeziehen. (B) Ventrale Motorwurzelaufzeichnung (VR) von fiktiven Schwimmkämpfen zeigt freiwillige motorische Befehle während der gesamten Dauer der Aufzeichnung. VR-Spikes (rote Punkte) werden mit einem ähnlichen Schwellenwertfilter erkannt und dann in einen einzigen Schwimmkampf (grün) einbindet, indem ein Aktivitätsschub innerhalb von 200 ms voneinander erkannt wird (siehe Einfügen; Skalierungsleiste stellt 200 ms dar). Spikes, die außerhalb des definierten Schwimmkampfes entdeckt werden, treten nicht innerhalb des Inter-Spike-Intervalls der stereotypen Burst-Aktivität auf und sind daher ausgeschlossen. (C) Mittlere spontane afferent Spike-Rate, zentriert auf den Beginn jedes Schwimmkampfes (Zeit = 0 s), was die Spike-Rate vor, während und nach dem Schwimmen veranschaulicht. Fehlerbalken stellen ± SEM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Quantifizierung der afferenten Aktivität vor, während und nach dem fiktiven Schwimmen. (A) Die affektive Spike-Rate ist während des Schwimmens signifikant reduziert und dieser Effekt bleibt auch danach bestehen. Statistisch ähnliche Gruppierungen werden mit a und b bezeichnet. (B) Längere Schwimmdauer korreliert mit einer verminderten afferenten Spike-Rate. (C-D) Schwimmfrequenz und Schwimm-Tastverhältnis zeigen keine Korrelation zur afferenten Spitzenrate. Alle Werte stellen mittelwert ± REM dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Das beschriebene experimentelle Protokoll bietet das Potenzial, endogene Veränderungen des sensorischen Inputs über motorisches Verhalten in einem intakten, sich verhaltenden Wirbeltier zu überwachen. Insbesondere beschreibt es einen In-vivo-Ansatz zur Durchführung simultaner extrazellulärer Aufnahmen von lateralen line afferenten Neuronen und ventralen motorischen Wurzeln in Larvenzebrafischen. Spontane affente Aktivität wurde zuvor bei Zebrafischen ohne Berücksichtigung einer möglichen gleichzeitigen motorischen Aktivität^{charakterisiert 1,2,39,40,41}. Ohne überwachung des Vorhandenseins motorischer Aktivität mit ventralen Wurzelaufzeichnungen wird die Entschlüsselung der afferenten Aktivität wahrscheinlich aufgrund des Einflusses der efferenten Hemmung während und sogar nach dem spontanen Schwimmen unterschätzt.

Elektrophysiologische In-vivo-Aufnahmen sind von Natur aus eine Herausforderung. Unserer Erfahrung nach ist die Aufrechterhaltung einer gesunden Vorbereitung der größte Faktor, um erfolgreiche, lang anhaltende Aufnahmen für affeente Neuronen und ventrale motorische Wurzeln zu erreichen. Um dies zu tun, ist es wichtig, nicht nur den schnellen Blutfluss zu identifizieren und zu überwachen, sondern auch die Textur der Haut und der darunter liegenden Muskulatur zu erkennen. Wir empfehlen, mehrere gelähmte Larven vor der weiteren Behandlung unter dem Mikroskop zu beobachten, um sich mit dem intrinsischen Blutfluss und dem Hautzustand gesunder Larven vertraut zu machen. Eine erfolgreiche ventrale Wurzelaufnahme durch die Haut erfordert eine glatte, gesunde Hautoberfläche, damit die Aufnahmeelektrode eine dichte Versiegelung erzeugt. Dieser Ansatz umgeht traditionelle Protokolle^37,42, die invasiv und zeitaufwendig sind, die eine Sezierung des Epithels erfordern, um die zugrunde liegende Muskulatur freizulegen. Eine Unannehmlichkeit der Aufzeichnung durch die Haut ist die potenzielle Variabilität in der Zeit, bevor Signale realisiert werden. Die Optimierung der Größe und Dauer des angelegten Unterdrucks verringert die Zeit, die für die Erstellung eines Signals erforderlich ist, und verbessert möglicherweise das Signal-Rausch-Verhältnis. Aufnahmen aus einem gesunden, aktiven Präparat sollten spontane afferente Spitzenraten zwischen 5-10 Hz mit fiktiven Schwimmkämpfen ergeben, die alle paar Sekunden auftreten.

Neben der Aufdeckung des motorischen Aktivitätszustands können ventrale Wurzelaufzeichnungen als Proxy für die Überwachung der efferenten Aktivität dienen, die sich parallel zu motorischen Befehlen entlädt, um die Laterallinienaktivität^30,31,32 sowie die Aktivität in homologen Haarzellsystemen (z. B. dem auditiven und vestibulären System^35,43,44,45) zu dämpfen. Efferente Neuronen befinden sich tief im Hinterhirn, was elektrophysiologische Aufzeichnungen von ihnen äußerst schwierig macht. Zebrafische sind ein genetisches Modellsystem, und unser Elektrophysiologie-Protokoll kann durch transgene Linien ergänzt werden, um Aspekte der Folgeentladung, der Empfindlichkeit der Haarzellen, der Exzitotoxizität und darüber hinaus kraftvoll zu untersuchen.