Summary

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

Published: January 30, 2021
doi:

Summary

여기서 우리는 3D 서스펜션 문화에서 표피 스페로이드의 체계적인 재배를 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 상피 조직 유형과 여러 인간의 질병 및 조건의 모델링에 사용하기위한 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

Abstract

상피 이장애는 만성 상처, 염증 및 모든 인간 암의 80 % 이상을 포함하여 다양한 인간 질환과 질병을위한 노드입니다. 안 감 조직으로, 피부 상피는 종종 부상의 대상이 되며 손상 된 조직을 복구 하는 데 필요한 세포 가소성을 획득 하 여 진화적으로 적응. 수년에 걸쳐, 시험관 내 및 전 생체 세포 기지를 둔 모형을 사용하여 상피 가소성을 연구하기 위하여 몇몇 노력이 있었습니다. 그러나, 이러한 노력은 상피 세포 가소성의 다양한 단계를 재구성하는 능력에 제한되었습니다. 우리는 여기에서 1 차적인 신생아 인간 각질 세포에서 3D 표피 스페로이드 및 표피 스페로이드 유래 세포를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 표피 스페로이드 배양의 용량을 기능적으로 모델링하여 각질 세포 생성 가소성의 뚜렷한 단계를 모델링하고 표피 스페로이드 재도금이 이질적인 정상적인 인간 각질 세포(NHKc) 배양을 풍부하게할 수 있음을 입증하여 인테그린α6 hi/EGFR로아티뉴세포 와 같은 강화된 스모티코세포 와 같은 스모티코세포 분뇨 를 특징으로 합니다. 우리의 보고서는 피부 각질 세포 가소성 및 표피 재생의 연구를 위한 높은 처리량 시스템의 발달 그리고 유지에 설명합니다.

Introduction

포유류 계층화 상피는 모든 생활 시스템에서 가장 복잡한 상피 아키텍처이며 가장 자주 손상과 부상의 대상이됩니다. 보호 조직으로서, 계층화된 상피는 복잡하고 효과적인 조직 손상 반응을 생성하기 위해 진화했습니다. 부상 시, 이러한 세포는 리니지 가소성 프로그램을 활성화해야하며, 이를 통해 부상당한 부위로 마이그레이션하여 수리1,2,3을수행할 수 있습니다. 이 다각적 인 응답은 제대로 이해되지 않은 몇 가지 순차적 단계에서 발생합니다.

상피 재생의 복잡한 과정을 연구하는 데 있어 가장 큰 장애물은 세포 재생의 정의된 단계에서 동적 세포 활동을 포착할 수 있는 높은 처리량 모델 시스템의 발굴에 있습니다. 생체 내 마우스 모델은 상처 치유에 대한 관련 통찰력을 제공하고 인간의 재생 과정을 가장 밀접하게 재구성하지만, 개발은 힘든 노력과 상당한 비용이 필요하므로 처리량 용량을 제한합니다. 따라서 높은 처리량 규모에서 인간 상피 조직 재생의 기능적 조사를 가능하게 하는 시스템을 확립해야 하는 중요한 필요성이 존재합니다.

최근 몇 년 동안, 확장성 도전을 충족하기 위해 몇 가지 시도가 있었다. 이것은 생체 내 재생 컨텍스트를 밀접하게 모방하는 혁신적인 생체 외 및 전 생체 내 세포 기반 모델의 큰 확장을 통해 볼 수 있습니다. 여기에는 오르간 온 칩4,스페로이드5,오르간구이드6및 organotypic 배양7의발전이 포함됩니다. 이러한 3D 셀 기반 시스템은 각각 고유한 이점을 제공하고 고유한 실험적 한계를 제시합니다. 현재까지 스페로이드 배양은 가장 비용 효율적이고 널리 사용되는 3D 세포 배양 모델로 남아 있습니다. 그리고 여러 보고서는 스페로이드 배양이 피부 줄기 세포 특성을 연구하는 데 사용될 수 있음을 나타내지만, 이러한 연구는 주로 동물 조직8,9,또는 진피 섬유 아세포10으로수행되었으며, 인간 표피 스페로이드 배양의 재생 특성을 철저히 특성화하는 보고가 거의 없습니다. 이 프로토콜에서 우리는 일반적인 인간 각질 세포 (NHKc)에서 표피 스페로이드 문화의 기능 개발, 문화 및 유지 보수를 자세히 설명합니다. 우리는 동등하게 시험관 내에서 표피 재생 및 각질 줄기 세포 가소성의 순차적 단계를 모델링하기 위해이 시스템의 유용성을 설명합니다.

Protocol

피부 표본의 수집 및 취급 및 인간 각질 세포의 격리를 위한 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 대학 (UofSC) IRB에 의해 검토되고 “인간 과목을 포함하지 않는 연구”로 분류되었습니다, 포피 표본은 일상적인 외과 적 절차 (신네이트 소년의 할례) 동안 생성 된 외과 폐기로, 완전히 식별 정보가 없는. 이 프로토콜은 또한 UofSC 생물 안전 위원회에 의해 정기적으로 검토되고 승인되었으며 모든 실험실 직원?…

Representative Results

피부 표피피스피어 분석 시 NHKc 배양은 96웰플레이트(도 1A)의아가로즈 코팅 된 우물에서 시드된다. 스페로이드 형성 세포는 48시간 이내에 자가 집계되어야 합니다. 자율 스페로이드 형성은 표준 반전 위상 대비 현미경을 사용하여 24 시간 초에 평가될 수 있습니다. 피부 표피구 형성 및 재도금 분석 모델은 표피 조직 재생의 다양한단계(도 1B). <strong class…

Discussion

3D 스페로이드 배양 시스템의 사용은 세포 줄기를 평가하는 데 광범위한 유틸리티를 가지고 있다. 이러한 시스템은 조직 줄기 세포의 농축을 향상시키기 위해 입증되었습니다13,아직 인간의 표피 줄기 세포의 연구를위한 자신의 유틸리티는 제한적으로 탐구하고있다. 여기서는 3D 배양 기술을 사용하여 인간 각질 세포 줄기 세포를 풍부하게 하는 전략을 설명합니다. 이 시스템에?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

UofSC 의과 대학 계측 자원 시설 (IRF)은 이미징 및 세포 선별 장비 및 기술 지원에 대한 액세스를 제공했습니다. 이 작업은 보조금 1R21CA201853에 의해 부분적으로 지원되었습니다. MCF와 IRF는 NIH 보조금 P20GM103499, SC INBRE로부터 부분 지원을 받습니다. MCF는 또한 NIH 보조금 P20GM109091의 지원을 받습니다. 이본 워피(Yvon Woappi)는 NIH 보조금 2R25GM066526-06A1(PREP)과 R25GM076277(IMSD)과 UofSC의 그레이스 조던 맥파든 교수 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다. 제럴딘 에제카와 저스틴 베르첼리노는 UofSC에서 NIH 보조금 2R25GM066526-10A1 (PREP)에 의해 지원되었다. 숀 M. 블로오스는 UofSC에서 2016 마젤란 학자 상을 수상했다.

Materials

Affymetrix platform Affymetrix For microarray experiments
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file Affymetrix Process
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent For microarray experiments
All Prep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204 Used for RNA isolation
Analysis Console Software version 3.0.0.466 analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance
BD FACSAria II flow cytometer Beckman For flow cytometry
Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
Cytokeratin 14 Santa Cruz Biotechnology sc-53253 1:200 dilution
Dispase Sigma-Aldrich D4818 For cell media
FITC-conjugated anti-integrinα6 Abcam ab30496 For FACS analysis
GeneChip Command Console 4.0 software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA
GeneChip Hybridization Oven 640 Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip Scanner 3000 7G system Affymetrix/Thermo Fisher Scientific Scanning hybridized arrays
GeneChip WT PLUS Reagent Kit Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For amplifycation of biotinylating total RNA
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) Cell Signaling Technology 8910 For cell media
Human Epidermal Growth Factor (hEGF) Cell Signaling Technology 8916 For cell media
Human Insulin Millipore Sigma 9011-M For cell media
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) Bio-Rad 1708880 Used for RT-qPCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Used for RT-qPCR
KSFM ThermoFisher Scientific 17005041 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
KSFM-scm ThermoFisher Scientific 17005042 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
MCDB 153-LB basal medium Sigma-Aldrich M7403 MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS Stellar Scientific NST230111 For immunostaining
P63 Thermo Scientific 703809 1:200 dilution
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) BD Pharmingen 555997 For FACS analysis
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector Addgene 20672 For transfection
Promega TransFast kit Promega E2431 For transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro Kit Qiagen For microarray experiments
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units Thermo Scientific 09-740-63D For cell media
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope Zeiss Use with Axiovision Rel. 4.5 software

Referências

  1. Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
  2. Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
  3. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
  4. Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
  5. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
  6. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  7. Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
  8. Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
  9. Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
  10. Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
  11. Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
  12. Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
  13. Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
  14. Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
  15. Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
  16. Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 – Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).

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Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity. J. Vis. Exp. (167), e62182, doi:10.3791/62182 (2021).

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