Summary

Het opzetten van een epidermale sferoïde cultuursysteem met hoge doorvoer om keratinocytstamcelplasticiteit te modelleren

Published: January 30, 2021
doi:

Summary

Hier beschrijven we een protocol voor de systematische teelt van epidermale sferoïden in 3D-suspensiecultuur. Dit protocol heeft uitgebreide toepassingen voor gebruik in een verscheidenheid van epitheelweefseltypes en voor het modelleren van verscheidene menselijke ziekten en voorwaarden.

Abstract

Epitheliale dysregulatie is een knooppunt voor een verscheidenheid aan menselijke aandoeningen en kwalen, waaronder chronische wondvorming, ontsteking en meer dan 80% van alle menselijke kankers. Als voeringsweefsel is het huidepitheel vaak onderhevig aan letsel en heeft het zich evolutionair aangepast door de cellulaire plasticiteit te verkrijgen die nodig is om beschadigd weefsel te herstellen. In de loop der jaren zijn verschillende inspanningen geleverd om epitheliale plasticiteit te bestuderen met behulp van in vitro en ex vivo celgebaseerde modellen. Deze inspanningen zijn echter beperkt in hun vermogen om de verschillende fasen van epitheliale celplasticiteit samen te vatten. We beschrijven hier een protocol voor het genereren van 3D epidermale sferoïden en epidermale sferoïde-afgeleide cellen van primaire neonatale menselijke keratinocyten. Dit protocol schetst het vermogen van epidermale sferoïde culturen om functioneel verschillende stadia van keratinocyt generatieve plasticiteit te modelleren en toont aan dat epidermale sferoïde re-plating heterogene normale menselijke keratinocyten (NHKc) culturen kan verrijken voor integrinα6hi/EGFRlo keratinocyt subpopulaties met verbeterde stamachtige kenmerken. Ons rapport beschrijft de ontwikkeling en het onderhoud van een systeem met hoge doorvoer voor de studie van de plasticiteit van keratinocyt en epidermale regeneratie van de huid.

Introduction

Het zoogdier gelaagde epitheel is de meest complexe epitheelarchitectuur in alle levende systemen en is meestal onderhevig aan schade en letsel. Als beschermend weefsel is gelaagd epitheel geëvolueerd om een complexe en effectieve weefselschaderespons te genereren. Bij letsel moeten deze cellen afstammingsplasticiteitsprogramma’s activeren, waarmee ze naar de gewonde plaats kunnen migreren en reparatie1,2,3kunnen uitvoeren. Deze veelzijdige reactie vindt plaats in verschillende opeenvolgende stappen die slecht begrepen blijven.

Een belangrijk obstakel bij het bestuderen van het ingewikkelde proces van epitheliale regeneratie ligt in het gebrek aan modelsystemen met hoge doorvoer die dynamische cellulaire activiteiten kunnen vastleggen in gedefinieerde stadia van celregeneratie. Hoewel in vivo muismodellen relevant inzicht bieden in wondgenezing en het menselijk regeneratieve proces het meest nauwkeurig samenvatten, vereist hun ontwikkeling moeizame inspanningen en aanzienlijke kosten, waardoor hun doorvoercapaciteit wordt beperkt. Er bestaat daarom een kritieke behoefte aan het opzetten van systemen die functioneel onderzoek van menselijke epitheliale weefselregeneratie op hoge doorvoerschaal mogelijk maken.

In de afgelopen jaren zijn verschillende pogingen gedaan om de schaalbaarheidsuitdaging aan te gaan. Dit wordt gezien door een grote uitbreiding van innovatieve in vitro en ex vivo celgebaseerde modellen die de in vivo regeneratieve context nauw nabootsen. Dit omvat vooruitgang in organ-on-chip4, sferoïde5, organoïde6en organotypische culturen7. Deze 3D-celgebaseerde systemen bieden elk unieke voordelen en bieden verschillende experimentele beperkingen. Tot op heden blijft sferoïde cultuur het meest kosteneffectieve en meest gebruikte 3D-celcultuurmodel. En hoewel verschillende rapporten hebben aangegeven dat sferoïde culturen kunnen worden gebruikt om huidstamcelkenmerken te bestuderen, zijn deze studies grotendeels uitgevoerd met dierlijk weefsel8,9, of met huidfibroblasten10, met vrijwel geen rapporten die de regeneratieve eigenschappen van menselijke epidermale sferoïdeculturen grondig karakteriseren. In dit protocol beschrijven we de functionele ontwikkeling, cultuur en het onderhoud van epidermale sferoïde culturen van normale menselijke keratinocyten (NHKc). We beschrijven ook het nut van dit systeem om de sequentiële fasen van epidermale regeneratie en keratinocytstamcelplasticiteit in vitro te modelleren.

Protocol

Het protocol voor het verzamelen en hanteren van huidmonsters en isolatie van menselijke keratinocyten is herzien door de IRB van de Universiteit van South Carolina (UofSC) en geclassificeerd als “onderzoek waarbij geen menselijke proefpersonen betrokken waren”, omdat de voorhuidmonsters chirurgische teruggooi waren die werden geproduceerd tijdens routinechirurgische procedures (besnijdenis van pasgeboren jongens) en volledig verstoken waren van identificerende informatie. Het protocol werd ook regelmatig herzien en goed…

Representative Results

Tijdens de huidepdermosfeertest worden NHKc-culturen gezaaid in met agarose bedekte putten van een 96-putplaat (figuur 1A). Sferoïdevormende cellen moeten zichzelf binnen 48 uur aggregeren. Autonome sferoïde vorming kan al na 24 uur worden beoordeeld met behulp van een standaard omgekeerde fasecontrastmicroscoop. huid epidermosfeer vorming en re-plating assay model verschillende fasen van epidermale weefsel regeneratie (Figuur 1B). Figuur …

Discussion

Het gebruik van 3D-sferoïde kweeksystemen heeft een breed nut gehad bij het beoordelen van celstamheid. Het is aangetoond dat deze systemen de verrijking van weefselstamcellenverbeteren 13, maar hun nut voor de studie van menselijke epidermale stamcellen is beperkt onderzocht. Hier beschrijven we een strategie voor het verrijken van menselijke keratinocytstamcellen met behulp van 3D-cultuurtechnieken. In dit systeem worden NHKc gekweekt als zelfassemblage multicellulaire sferoïde suspensuspensen…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) bood toegang tot beeldvormings- en celsorteerapparatuur en technische bijstand. Dit werk werd mede ondersteund door subsidie 1R21CA201853. De MCF en de IRF ontvangen gedeeltelijke steun van NIH-subsidie P20GM103499, SC INBRE. Het MCF ontvangt ook steun van NIH-subsidie P20GM109091. Yvon Woappi werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidies 2R25GM066526-06A1 (PREP) en R25GM076277 (IMSD), en door een Fellowship door het Grace Jordan McFadden Professors Program aan UofSC. Geraldine Ezeka en Justin Vercellino werden ondersteund door NIH-subsidies 2R25GM066526-10A1 (PREP) bij UofSC. Sean M. Bloos werd ondersteund door de Magellan Scholar Award 2016 bij UofSC.

Materials

Affymetrix platform Affymetrix For microarray experiments
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file Affymetrix Process
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent For microarray experiments
All Prep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204 Used for RNA isolation
Analysis Console Software version 3.0.0.466 analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance
BD FACSAria II flow cytometer Beckman For flow cytometry
Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
Cytokeratin 14 Santa Cruz Biotechnology sc-53253 1:200 dilution
Dispase Sigma-Aldrich D4818 For cell media
FITC-conjugated anti-integrinα6 Abcam ab30496 For FACS analysis
GeneChip Command Console 4.0 software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA
GeneChip Hybridization Oven 640 Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip Scanner 3000 7G system Affymetrix/Thermo Fisher Scientific Scanning hybridized arrays
GeneChip WT PLUS Reagent Kit Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For amplifycation of biotinylating total RNA
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) Cell Signaling Technology 8910 For cell media
Human Epidermal Growth Factor (hEGF) Cell Signaling Technology 8916 For cell media
Human Insulin Millipore Sigma 9011-M For cell media
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) Bio-Rad 1708880 Used for RT-qPCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Used for RT-qPCR
KSFM ThermoFisher Scientific 17005041 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
KSFM-scm ThermoFisher Scientific 17005042 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
MCDB 153-LB basal medium Sigma-Aldrich M7403 MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS Stellar Scientific NST230111 For immunostaining
P63 Thermo Scientific 703809 1:200 dilution
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) BD Pharmingen 555997 For FACS analysis
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector Addgene 20672 For transfection
Promega TransFast kit Promega E2431 For transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro Kit Qiagen For microarray experiments
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units Thermo Scientific 09-740-63D For cell media
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope Zeiss Use with Axiovision Rel. 4.5 software

Referências

  1. Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
  2. Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
  3. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
  4. Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
  5. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
  6. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  7. Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
  8. Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
  9. Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
  10. Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
  11. Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
  12. Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
  13. Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
  14. Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
  15. Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
  16. Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 – Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).

Play Video

Citar este artigo
Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity. J. Vis. Exp. (167), e62182, doi:10.3791/62182 (2021).

View Video