Summary

הקמת מערכת תרבית אפידרמיס כדורית בעלת תפוקה גבוהה למודל פלסטיות תאי גזע קרטינוציטים

Published: January 30, 2021
doi:

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיפוח שיטתי של כדורי אפידרמיס בתרבות השעיה תלת-ממדית. פרוטוקול זה כולל יישומים נרחבים לשימוש במגוון סוגי רקמות אפיתל ולדוגמנות של מספר מחלות ותנאים אנושיים.

Abstract

דיסרגציה אפיתל היא צומת עבור מגוון רחב של מצבים אנושיים ומחלות, כולל פצעים כרוניים, דלקת, ומעל 80% של כל סוגי הסרטן האנושי. כרקמת בטנה, אפיתל העור נתון לעתים קרובות לפציעה והותאם אבולוציונית על ידי רכישת הפלסטיות התאית הדרושה לתיקון רקמות פגומות. במהלך השנים נעשו מספר מאמצים לחקור פלסטיות אפיתל באמצעות מודלים מבוססי תאי במבחנה ואקס ויוו. עם זאת, מאמצים אלה הוגבלו ביכולתם לשחזר את השלבים השונים של פלסטיות תאי האפיתל. אנו מתארים כאן פרוטוקול ליצירת כדורי אפידרמיס תלת-ממדיים ותאים שמקורם בספירואיד אפידרמלי מקריטינוציטים אנושיים יילודים ראשוניים. פרוטוקול זה מתאר את היכולת של תרביות ספרואיד אפידרמיס מודל פונקציונלי שלבים נפרדים של פלסטיות יוצרת קרטינוציטים ומדגים כי ציפוי מחדש של כדורי אפידרמלי יכול להעשיר תרביות קרטינוציטים אנושיים נורמליים הטרוגניים (NHKc) עבור integrinα6hi/ EGFRlo keratinocyte subpocyte עם מאפיינים דמויי גזע משופרים. הדו”ח שלנו מתאר את הפיתוח והתחזוקה של מערכת תפוקה גבוהה לחקר פלסטיות קרטינוציטים בעור והתחדשות אפידרמלית.

Introduction

האפיתל המרובד של היונקים הוא הארכיטקטורה האפיתלית המורכבת ביותר בכל מערכות החיים, והוא נתון לרוב לנזק ופציעה. כרקמת הגנה, אפיתל רבדים התפתח כדי ליצור תגובת נזק לרקמות מורכבת ויעילה. עם הפגיעה, תאים אלה חייבים להפעיל תוכניות פלסטיות שושלת, המאפשרות להם לנדוד לאתר הפגוע ולבצעתיקון 1,2,3. תגובה רבת פנים זו מתרחשת במספר שלבים רציפים שנותרו מובנים היטב.

מכשול מרכזי בחקר התהליך המורכב של התחדשות אפיתל טמון במחסור במערכות מודל תפוקה גבוהה שיכולות ללכוד פעילויות תאיות דינמיות בשלבים מוגדרים של התחדשות תאים. בעוד שמודלים של עכברי vivo מציעים תובנה רלוונטית על ריפוי פצעים ומחדשים מקרוב את תהליך ההתחדשות האנושית, ההתפתחות שלהם דורשת מאמצים מייגעים ועלות משמעותית, ומגבילה את יכולת התפוקה שלהם. קיים, אם כן, צורך קריטי בהקמת מערכות המאפשרות חקירה תפקודית של התחדשות רקמת אפיתל אנושית בקנה מידה גבוה של תפוקה.

בשנים האחרונות נעשו מספר ניסיונות לעמוד באתגר המדרגיות. זה בא לידי ביטוי באמצעות התרחבות גדולה של דגמים חדשניים במבחנה ובאקס ויוו המבוססים על תאים המחקים מקרוב את ההקשר המתחדש של in vivo. זה כולל התקדמות איבר על שבב4,ספרואיד5,organoid6, ותרבויות אורגנוטיפיות7. מערכות תלת-ממדיות אלה מבוססות תא כל אחת מציעות יתרונות ייחודיים ומציגות מגבלות ניסיוניות ברורות. עד כה, תרבות כדורית נותרה המודל החסכוני ביותר של תרבית תאים תלת-ממדית בשימוש נרחב. ובעוד מספר דיווחים הצביעו על כך שניתן להשתמש בתרביות כדוריות כדי לחקור את מאפייני תאי הגזע של העור, מחקרים אלה נערכו במידה רבה עם רקמת בעלי חיים8,9, או עם פיברובלסטים עוריים10, עם כמעט שום דיווחים המאפיינים ביסודיות את המאפיינים המתחדשים של תרביות ספרואיד אפידרמיס אנושיות. בפרוטוקול זה אנו מפרטים את ההתפתחות התפקודית, התרבות והתחזוקה של תרביות כדוריות אפידרמיסיות מקרטינוציטים אנושיים רגילים (NHKc). אנו מתארים באותה מידה את התועלת של מערכת זו כדי לדגמן את השלבים הרציפים של התחדשות אפידרמלית ופלסטיות תאי גזע קרטינוציט במבחנה.

Protocol

הפרוטוקול לאיסוף וטיפול בדגימות עור ובידוד של קרטינוציטים אנושיים נבדק על ידי אוניברסיטת דרום קרוליינה (UofSC) IRB ומסווג כ”מחקר שאינו מעורב בנושאים אנושיים “, שכן דגימות העורלה היו פסולת כירורגית שהופקה במהלך הליכים כירורגיים שגרתיים (ברית מילה של נערי ניאון) והיו נטולות מידע מזהה לחלוטין. ה?…

Representative Results

במהלך בדיקת האפידרמוספרה של העור, תרביות NHKc נזרעות בבארות מצופות אגרוז של צלחת 96 באר(איור 1A). תאים היוצרים כדוריים צריכים לצבור את עצמם בתוך 48h. היווצרות כדורית אוטונומית ניתן להעריך כבר 24 שעות באמצעות מיקרוסקופ פזה הפוך סטנדרטי. היווצרות אפידרמוספרה בעור וציוץ מחדש מודלים…

Discussion

השימוש במערכות תרבית כדורית תלת-ממדית היה בעל תועלת רחבה בהערכת גזע התאים. מערכות אלה הוכחו כדי לשפר את העשרה של תאי גזערקמה 13, עדיין התועלת שלהם לחקר תאי גזע אפידרמיס אנושי נחקרה באופן מוגבל. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה להעשרת תאי גזע קרטינוציטים אנושיים בטכניקות תרבית תלת-ממדי?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

בית הספר לרפואה UofSC מתקן משאבים מכשור (IRF) סיפק גישה ציוד הדמיה ומיון תאים וסיוע טכני. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק 1R21CA201853. ה- MCF וה- IRF מקבלים תמיכה חלקית ממענק NIH P20GM103499, SC INBRE. ה- MCF מקבל גם תמיכה ממענק NIH P20GM109091. איבון וופי נתמך בחלקו על ידי מענקי NIH 2R25GM066526-06A1 (PREP) ו- R25GM076277 (IMSD), ועל ידי מלגה על ידי גרייס ג’ורדן מקפאדן פרופסורים תוכנית UofSC. ג’רלדין אזקה וג’סטין Vercellino נתמכו על ידי מענקי NIH 2R25GM0666526-10A1 (PREP) ב UofSC. שון מ. בלוס נתמך על ידי פרס מגלן מלומד לשנת 2016 באוניברסיטת UofSC.

Materials

Affymetrix platform Affymetrix For microarray experiments
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file Affymetrix Process
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent For microarray experiments
All Prep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204 Used for RNA isolation
Analysis Console Software version 3.0.0.466 analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance
BD FACSAria II flow cytometer Beckman For flow cytometry
Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
Cytokeratin 14 Santa Cruz Biotechnology sc-53253 1:200 dilution
Dispase Sigma-Aldrich D4818 For cell media
FITC-conjugated anti-integrinα6 Abcam ab30496 For FACS analysis
GeneChip Command Console 4.0 software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA
GeneChip Hybridization Oven 640 Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip Scanner 3000 7G system Affymetrix/Thermo Fisher Scientific Scanning hybridized arrays
GeneChip WT PLUS Reagent Kit Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For amplifycation of biotinylating total RNA
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) Cell Signaling Technology 8910 For cell media
Human Epidermal Growth Factor (hEGF) Cell Signaling Technology 8916 For cell media
Human Insulin Millipore Sigma 9011-M For cell media
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) Bio-Rad 1708880 Used for RT-qPCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Used for RT-qPCR
KSFM ThermoFisher Scientific 17005041 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
KSFM-scm ThermoFisher Scientific 17005042 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
MCDB 153-LB basal medium Sigma-Aldrich M7403 MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS Stellar Scientific NST230111 For immunostaining
P63 Thermo Scientific 703809 1:200 dilution
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) BD Pharmingen 555997 For FACS analysis
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector Addgene 20672 For transfection
Promega TransFast kit Promega E2431 For transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro Kit Qiagen For microarray experiments
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units Thermo Scientific 09-740-63D For cell media
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope Zeiss Use with Axiovision Rel. 4.5 software

Referências

  1. Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
  2. Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
  3. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
  4. Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
  5. Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
  6. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  7. Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
  8. Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
  9. Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
  10. Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
  11. Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
  12. Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
  13. Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
  14. Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
  15. Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
  16. Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 – Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).

Play Video

Citar este artigo
Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity. J. Vis. Exp. (167), e62182, doi:10.3791/62182 (2021).

View Video