Vi beskriver en metode til at opnå primære kulturer af kegle fotoreceptorer fra nethinden af kyllingembryoner og dens anvendelse til screening med højt indhold.
Human dagtimerne vision bygger på funktionen af kegle fotoreceptorer i midten af nethinden, fovea. Patienter, der lider af den mest udbredte form for arvelig nethinde degeneration, retinitis pigmentosa, mister nattesyn på grund af mutation drevet tab af stang fotoreceptorer, et fænomen efterfulgt af en progressiv tab af funktion og død af kegler, der fører til blindhed. Genetikere har identificeret mange gener med mutationer forårsager denne sygdom, men de første identificerede mutationer spørgsmålstegn ved mekanismerne i sekundære kegle degeneration og hvordan en dominerende mutation i rhodopsin genkodning for det visuelle pigment udelukkende udtrykt i stænger kan udløse kegle degeneration.
Dette resultat af transplantationer i en genetisk model af sygdommen førte til begrebet celleinteraktioner mellem stænger og kegler og af ikke-celle autonom degeneration af kegler i alle genetiske former for retinitis pigmentosa.
Kegler udgør 5% af alle fotoreceptorer hos mennesker og kun 3% i musen, så deres undersøgelse er vanskelig i disse arter, men kegler overtal stænger i fuglearter. Vi har tilpasset 96-brøndsplader til kultur nethindeprækursorer fra nethinden af kyllingembryoner på 29. fase af deres udvikling. I disse primære kulturer udgør kegler 80% af cellerne efter in vitro differentiering. Cellerne degenererer over en periode på en uge i mangel af serum. Her beskriver vi metoderne og dens standardisering.
Dette kegleberigede kultursystem blev brugt til at identificere den epitelbaserede kegle-levedygtighedsfaktor (EdCVF) ved screening med højt indhold af et rottehindepigmenteret epitel normaliseret cDNA-bibliotek. Rekombinant EdCVF forhindrer degeneration af keglerne.
Nethinden af hvirveldyr arter er dobbelt, med stang fotoreceptorer for svagt lys vision og kegle fotoreceptorer til dagslys, farve og skarphed vision. Primat synsstyrke er afhængig af en region i centrum af nethinden, kaldet fovea, der er beriget med kegler, men generelt udgør kegler kun 5% af alle fotoreceptorer. Derfor er analysen af keglerne i primat nethinden og især kulturen af kegler teknisk vanskelig. Alle andre pattedyrarter har ingen fovea, og procentdelen af kegler er lav for gnavere, der oftest anvendes i nethindeforskning. Dette er ikke tilfældet for fuglearter, for hvilke kegler dominerer nethinden af disse godt at se fuglearter. Dinosaurer, som har domineret økosystemet, da pattedyrene først dukkede op under evolutionen, er på fuglens fylogenetiske oprindelse1. Som følge af en sådan konkurrence mellem dinosaurer og tidlige pattedyr er pattedyrene for det meste natlige med nethinder domineret af stænger. Først senere under evolutionen blev den daglige vision af nogle pattedyrsarter, blandt hvilke primater tilhører, en evolutionær fordel. Ikke desto mindre forbliver forfædrenes periode som en atavisme af den natlige flaskehals i udviklingen af pattedyrssyn2,3.
Mens de studerede nethindecelledifferentiering, viste Adler og Hatlee, at fotoreceptorer udgør ca. 70% af de retinale differentierede celler i kulturer afledt af kylling på den embryonale dag (ED) 6 eller fase 294. På grund af forekomsten af kegler i kyllingehinden er kulturer af nethindeceller fra ED6 kyllingembryoner blevet udviklet som kegleberigede kulturer5.
Betydningen af kegle-medieret synsstyrke for mennesker er en truism. Mennesker ramt af genetiske eller aldrende sygdomme, der ændrer kegle funktion er stærkt handicappede. Dette har fremmet en meget stor mængde undersøgelser af arvelige nethindegenerationer (IRD) med det formål at finde behandlinger for disse blændende sygdomme6,7. Den første succes, opnået ved hjælp af en rekombinant adeno-associeret vektor (AAV) til behandling af en alvorlig form for IRD Leber medfødt amaurosis (LCA), er et bevis på konceptet for genterapi8. Identifikationen af de gener, hvis mutationer udløser IRD åbner mulighed for at helbrede disse sygdomme ved hjælp af genterapi. Ikke desto mindre er disse sygdomme skyldes mutationer i mere end 200 forskellige gener9. Selv i tilfælde af autosomale recessive former for IRD, når genindførelsen af den normale kopi af morbid genet kunne genoprette visuel funktion, favoriserer de økonomiske omkostninger ved hver enkelt udvikling de mest udbredte til skade for de mindre almindelige og for dem, for hvilke den genetiske oprindelse forbliver ukendt. Denne kendsgerning fik forskere til at tænke på mere generelle behandlinger. Apoptotisk celledød optrådte som en fælles vej, og et terapeutisk mål for disse sygdomme, der skrider frem ved degeneration af fotoreceptorer, herunder for autosomale dominerende former10,11. Succeserne med en sådan tilgang mangler imidlertid. For den mest almindelige form for IRD, retinitis pigmentosa (RP), den fælles vej er det sekundære tab af funktion i sidste ende efterfulgt af degeneration af kegler12,13. Forebyggelse af tab af keglefunktion vil bevare det centrale syn af fovea uafhængigt af de forårsagende mutationer14.
I den tidlige fase af RP udløser tabet af stænger en reduktion i udtrykket af stangafledt keglelevedygtighedsfaktor (RdCVF), kodet af det nucleoredoxin-lignende 1 (NXNL1) gen, som afbryder det metaboliske og redox-signalering mellem stænger og kegler15. Indgift af en rekombinant AAV, der indkapsler de to produkter fra NXNL1-genet, trofisk faktoren RdCVF og thioredoxinenzymet RdCVFL, kunne teoretisk forhindre keglesynstab i alle genetiske former for RP16. Vi har vist, at NXNL1-genproduktet, RdCVFL, udtrykkes i kyllingekeglerberigede kulturer17, og hvor det spiller en beskyttende rolle18. RdCVF og NXNL1 genet blev identificeret ved højt indhold screening af en nethinde cDNA bibliotek ved hjælp af overlevelse af celler fra en kegle-beriget kultur som udlæsning19. Vi screenede hvad der svarer til 210.000 individuelle kloner af biblioteket ved hjælp af 8 parallelle tests for hver klon. Dette repræsenterer et meget stort antal test, der kræver nem adgang til det biologiske materiale, nethinden af kyllingembryoner. Vi fandt ud af, at det var relativt let at få embryonerede kyllingæg på ugentlig basis, fordi de er bredt produceret til agroindustrien til æglæggende høner og kødproducerende kyllinger. Efter omhyggelig standardisering af kegle-berigede kulturer, giver systemet en nem, robust og reproducerbar måde at teste tusindvis af molekyler for deres evne til at bevare kegle levedygtighed. Disse celler kan også bruges til genmanipulationer20 , der gavner studiet af signaltransduktion og biokemiske analyser21,22,23.
Nethindeforskere har udviklet alternative metoder som brugen af keglecellelinjen 661W24,25,26. Ikke desto mindre er identiteten af denne cellelinje stadig kontroversiel27,28. De 661W celler blev klonet fra nethinde tumorer af en transgen mus linje, der udtrykker SV40 store T antigen under kontrol af den menneskelige interphotoreceptor retinol-bindende protein promotor. SV40 store T antigen formidler cellulære transformation og udødeliggørelse. Som følge heraf skal signalvejen identificeret ved hjælp af 661W celler rapporteres ind i konteksten af en transformeret og udødeliggjort cellelinje, der på mange måder adskiller sig fra kegler på stedet. I den henseende består det kegleberigede kultursystem af primære neuroner, keglerne, der er mere fysiologisk relevante.
Selv om det er muligt at opnå en ren kultur af fotoreceptorer ved hjælp af vibratome sektion af musen nethinden, den meget lave procentdel af kegler i den ydre nethinden af gnavere gør denne tilgang uegnet til fremstilling af kegle-beriget kulturer29. Svinehinden indeholder ingen fovea, men har en region kaldet area centralis, der er meget beriget med kegler30. Den høje andel af kegler i nethinden døgn gnavere, som Arvicanthis ansorgei og Psammomys obsesus31,32, tilbyder en mulig løsning, men kræver opdræt af sådanne eksotiske arter. Voksne svineøjne, indsamlet fra lokale slagterier, kan bruges til at producere en blandet kultur af stænger og kegler, der er blevet brugt til at studere fotoreceptor overlevelse33. En elegant løsning er at forrense kegler fra grisen nethinden ved hjælp af panorering med peanut agglutinin (PNA) lectin, som selektivt binder sig til kegler34. Ikke desto mindre er denne metode vanskelig at gennemføre i stor skala på grund af dens kompleksitet.
Human induceret pluripotente stamceller (iPS) tilbyder den mest lovende tilgang til at opnå en kegle fotoreceptor cellepopulation, der kan bruges til nethindetransplantation, men som også kan tilpasses til kegleberiget kultur35,36. Da transskription faktor NRL er påkrævet for stang-fotoreceptorer37, nrl-/- musen har en nethinden domineret af korte bølge kegler (S-kegler). Inaktivering kan bruges til at fremstille S-kegleberiget præparat ved at skelne mellem mennesker og iPS38,39. En anden mulig tilgang er at fremme kegle differentiering ved hjælp af skjoldbruskkirtelhormon signalering40. Mens nye metoder til fremstilling af kegleberigede kulturer fra menneskelig iPS er ved at opstå, giver kyllingembryoner en aktuel dokumenteret metode19.
Den kegleberigede kultur var medvirkende til identifikationen af RdCVF ved at klone19. Dette system blev også brugt med succes til at påvise, at RdCVF stimulerer glukoseoptagelsen og dens metabolisme ved aerob glykolyse22. Desuden blev kegleberiget kultur brugt til at validere den beskyttende rolle, som RdCVFL, det andet produkt af NXNL1-genet 23. For nylig blev dette system brugt til at demonstrere eksistensen af beskyttelse af molekyler udskilles af retinale pigmenterede epitelceller transduceret med OTX241.
Blandt de mange parametre, der kan begrænse produktionen af en kegleberiget kultur fra kyllingembryoner, er det første kritiske skridt at nøjagtigt identificere udviklingsstadiet for embryonerne i de udklækkede æg. Det er blevet observeret, at dyrkning af celler fra nethinden af embryoner på ED8(34 th fase) producerer kun 35% fotoreceptorer, med de resterende 65% er lavet af andre neuroner4. Uanset hvilken logistik der anvendes til at få de udklækkede æg, er det nødvendigt at finjustere temperaturen og inkubationstiden og omhyggeligt undersøge embryonerne sammenlignet med referencebillederne af alle udviklingsstadier42,45.
Oprindeligt blev kegleberiget kultursystem udviklet ved hjælp af White Leghorn stamme4. Den hvide farve af æggene af denne stamme er ikke særlig værdsat i Frankrig, så vi brugte en stamme af kylling, der producerer brune æg. Vi udnyttede I 657-stammen, som foretages ved at krydse I 66 roosters med JA57 høns5. Vi var i stand til at reproducere de oprindelige kulturers egenskaber. Dette viser, at kyllingens genetiske baggrund ikke er kritisk for at opnå kegleberigede kulturer.
Vi har ikke testet effekten af individuel fjernelse af kosttilskud i kulturmediet, men har observeret, at insulin spiller en kritisk rolle i overensstemmelse med insulinets virkning på overlevelsen af kegler i rd1-musen, en model af autosomal recessiv RP46. Triiodothyronine (T3) kan også deltage i differentieringen af retinale prækursorceller af kyllingembryoet i kegler i henhold til skjoldbruskkirtelhormonreceptorens rolle i nethindecelle skæbne under udvikling40. Derfor kan det kegleberigede dyrkningssystem ikke bruges til at identificere insulin ved at udtrykke kloning46.
Kegle-beriget kultur system er afhængig af kulturen i primære neuroner og er langt mere passende tha metoder afhængige af brugen af udødeliggjorte celler som celle linje 661W24,25,26.
Den her beskrevne metode kan ændres ved at udføre en tidligere elektroporation med plasmid DNA20. Før nethindecelleaffjedringen forberedes, anbringes hele nethinden i kammeret på en specialfremstillet elektroporator med 120 μL på 0,5 μg/μL plasmid-DNA i 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA. Fem impulser på 15 V for 50 ms hver påføres adskilt af 950 ms interval22. Forsøg på at levere forstyrrende RNA (RNAi) ved hjælp af replikation kompetente aviær splejsning (RCAS) retrovirus i kegle-beriget kulturer mislykkedes47. Dette skyldes helt sikkert, at i mangel af serum og i kulturer med lav densitet er nethindeprækursorceller ikke repliktive, en forudsætning for spredning af retrovirus.
Vi udviklede kegle-beriget kultur system til at identificere trofiske faktorer, der fremmer kegle overlevelse ved hjælp af udtryk kloning19. For at gøre det muligt udførte vi et første trin i screening med højt indhold ved hjælp af konditioneret medium fra puljer på 100 kloner. Selv om cDA’erne fra biblioteket udtrykkes under kontrol af en stærk CMV-promotor efter transinfektion af COS-1-celler, giver det ikke garanti for, at alle proteiner, der er kodet af individuelle cDA’er, når en koncentration, der er tilstrækkelig til at blive scoret positiv af rentabilitetsanalysen. Dette er en stor begrænsning. I den forstand er enhver screening ikke rigtig udtømmende. Hertil kommer, at selv om membranholdige proteiner ikke blev fjernet fra det betingede medium, er analysens konfiguration ugunstig for identifikationen af ikke-diffusive faktorer. Et alternativ ville være at screene individuelle kloner efter at have opnået rækkefølgen af cDA’erne for at undgå dobbeltarbejde i assaying mange gange det samme kandidatprotein. Dette blev indledt ved sekventering af nethinde cDNA biblioteker vi brugte43. Selv om denne tilgang er rationel, har den også sine begrænsninger. Den bioinformatiske analyse af cDNA-sekvenserne vil u uimodståeligt ud over reduktionen af redundansen pålægge prioriteringen af screening af visse kloner baseret på viden. Dette vil ikke være skadeligt, hvis endelig ville hele biblioteket blive screenet, selvom den tid, der kræves for at gøre det, vil blive væsentligt forlænget. Men uvægerligt vil sekvensens identitet påvirke vores måde at se på resultaterne på. Dette vil ikke være neutralt, da fortolkningen af sekvensen naturligvis vil være i konkurrence med forsøgsdataene.
Identifikationen af EdCVF viser også, at screening med højt indhold indebærer tekniske begrænsninger. Fra første screeningsrunde identificerede vi to puljer med høj aktivitet(supplerende figur 1). Puljen 0073 førte til en vellykket identifikation af EdCVF, mens pool 0080 ikke førte til en sådan konstatering. Vi har ikke løst det problem, der kan opstå som følge af tabet af den aktive klon under forberedelsen af underpuljer. Alternativt er det ikke udelukket, selv om det ikke er statistisk gunstigt, at der blandt CDA’erne for pulje 0080 handlede to proteiner synergistisk, og deres aktivitet kunne ikke observeres som individuelle kloner.
Identifikationen af molekyler, der beskytter kegler ved at screene små molekyler, er en fremtidig anvendelse af det kegleberigede kultursystem. Sådanne molekyler vil være uvurderlige til behandling af nethindepatologier, for hvilke genterapi ikke er den mest hensigtsmæssige tilgang som aldersrelateret makuladegeneration.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Jacques Bellalou, Lorelei Fournier, Emmanuelle Clérin, Frédéric Blond og entreprise agricole à responsabilité limitée (EARL Morizeau Dangers, Frankrig) for deres uvurderlige hjælp. Dette arbejde blev støttet af Inserm, Sorbonne University, Agence Nationale pour la Recherche (ANR, Labex Lifesenses), Foundation Fighting Blindness (USA) og IHU FOReSIGHT [ANR-18-IAHU-0001] støttet af franske statslige midler, der forvaltes af ANR inden for Investissements d’Avenir-programmet.
96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated) | Corning | 3603 | |
Calcein AM | Thermo-Fisher scientific | C1430 | |
CCD Camera | Photometrics | CoolSnap FX HQ | |
CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | C0256 | |
CO2 Independant | Thermo-Fisher scientific | 18045-054 | |
Curved forceps | Dutscher | 005093 | |
DMEM Media | Thermo-Fisher scientific | 41966-029 | |
DNAse | Sigma-Aldrich | D4263 | |
Eggs incubator | FarmLine | M08 01 3100 | |
Ethidium Homodimer | Thermo-Fisher scientific | E1169 | |
Fœtal bovine serum | Thermo-Fisher scientific | 10270-098 | |
Gentamycin | Thermo-Fisher scientific | 15710-049 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0880 | |
ITS (insulin Transferine selenium) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
large straight pliers | Dutscher | 005074 | |
Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L8384 | |
M199 medium | Thermo-Fisher scientific | 31150-022 | |
Metamorph software | Metamorph | ||
Microscope | NIKON | Eclipse TE2000 | |
Motorized stage | Martzauzer | Mutlicontrol 2000 | |
Optical filter switch | Shutter Instrument company | Lambda 10-2 | |
PBS 1X | Thermo-Fisher scientific | 14190-086 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
Pursept A express | Fisher scientific | 11814110 | |
Putriscine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
straight forceps | Dutscher | 005092 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
Trypan blue | Thermo-Fisher scientific | 15250-061 | |
Trypsine 0.25 % | Thermo-Fisher scientific | 25200-056 |