مخروط المخصب الثقافات من شبكية العين من أجنة الدجاج لدراسة رود إلى مخروط التفاعلات الخلوية

شبكية العين من الأنواع الفقارية مزدوجة، مع مستقبلات ضوئية قضيب لرؤية الضوء الخافت وتصورات ضوئية مخروطية لضوء النهار واللون والرؤية حدة. تعتمد حدة البصر الرئيسيات على منطقة في مركز شبكية العين ، تسمى fovea ، يتم تخصيبها في المخاريط ، ولكن بشكل عام ، تمثل المخاريط 5٪ فقط من جميع المستقبلات الضوئية. وبالتالي ، فإن تحليل المخاريط في شبكية العين الرئيسيات وخاصة ثقافة المخاريط صعبة من الناحية الفنية. جميع أنواع الثدييات الأخرى ليس لها fovea والنسبة المئوية للمخاريط منخفضة للقوارض التي تستخدم عادة في أبحاث الشبكية. وهذا ليس هو الحال بالنسبة لأنواع الطيور، التي تهيمن المخاريط على شبكية العين من هذه الأنواع الطيور رؤية جيدة. الديناصورات، التي هيمنت على النظام الإيكولوجي عندما ظهرت الثدييات لأول مرة أثناء التطور، هي في الأصل النباتي للطيور¹. ونتيجة لمثل هذه المنافسة بين الديناصورات والثدييات المبكرة ، فإن الثدييات ليلية في الغالب مع شبكية العين التي تهيمن عليها القضبان. وفي وقت لاحق فقط خلال التطور أصبحت الرؤية النهارية لبعض أنواع الثدييات، التي تنتمي منها الرئيسيات، ميزة تطورية. ومع ذلك، تبقى فترة الأجداد كتكادة من عنق الزجاجة الليلية في تطور رؤية الثدييات^2،3.

أثناء دراسة تمايز خلايا الشبكية، أظهر أدلر وهاتلي أن المستقبلات الضوئية تمثل ما يقرب من 70٪ من الخلايا المتمايزة في الشبكية في الثقافات المشتقة من الدجاج في اليوم الجنيني (ED) 6 أو المرحلة 29⁴. بسبب انتشار المخاريط في شبكية العين الدجاج، وقد وضعت ثقافات خلايا الشبكية من أجنة الدجاج ED6 كثقافات المخصب^{مخروط 5}.

إن أهمية حدة البصر بوساطة المخروط بالنسبة للإنسان هي حقيقة بديهية. الأشخاص المتضررين من الأمراض الوراثية أو الشيخوخة التي تغير وظيفة المخروط معوقون إلى حد كبير. وقد عزز هذا مجموعة كبيرة جدا من الدراسات على الضمور الشبكية الموروثة (IRD) بهدف إيجاد علاجات لهذه الأمراض المسببة للعمى^6،7. النجاح الأول، التي تم الحصول عليها باستخدام ناقلات أدينو المؤتلفة المرتبطة (AAV) لعلاج شكل حاد من IRD ليبر amaurosis الخلقية (LCA)، هو دليل على مفهوم للعلاج الجيني⁸. إن تحديد الجينات التي تؤدي طفراتها إلى الإصابة بأمراض القلب والأمراض المعدية ويفتح إمكانية علاج هذه الأمراض باستخدام العلاج الجيني. ومع ذلك، فإن هذه الأمراض تنتج عن الطفرات في أكثر من 200 جينات^{متميزة 9}. وحتى في حالة الأشكال المتنحية الذاتية ل IRD، عندما يمكن لإعادة إدخال النسخة العادية من الجين المهووس أن تستعيد الوظيفة البصرية، فإن التكلفة الاقتصادية لكل تطور فردي تفضل أكثرها انتشارا على حساب تلك الأقل شيوعا وتلك التي لا يزال الأصل الوراثي مجهولا لها. هذه الحقيقة دفعت الباحثين إلى التفكير في علاجات أكثر عمومية. ظهر موت الخلايا المبرمج كمسار مشترك ، وهدف علاجي لهذه الأمراض التي تتقدم عن طريق انحطاط المستقبلات الضوئية ، بما في ذلك الأشكال المهيمنة الذاتية^10،11. بيد أن النجاحات التي حققها هذا النهج مفقودة. بالنسبة للشكل الأكثر شيوعا من IRD ، التهاب الشبكية الصباغي (RP) ، فإن المسار الشائع هو فقدان الوظيفة الثانوي يليه في نهاية المطاف انحطاط المخاريط^12،13. منع فقدان وظيفة مخروط سوف تحافظ على الرؤية المركزية للfovea بشكل مستقل عن الطفرات المسببة¹⁴.

في المرحلة المبكرة من RP ، يؤدي فقدان القضبان إلى انخفاض في التعبير عن عامل صلاحية المخروط المشتقة من القضيب (RdCVF) ، المشفر بواسطة الجين 1(NXNL1)الشبيه بالنيوكليوريدوكسين ، والذي يقطع إشارات التمثيل الغذائي والأكسدة بين القضبان والمخاريط^15. إدارة AAV المؤتلف ترميز اثنين من منتجات الجين NXNL1، عامل الغذائية RdCVF وانزيم thioredoxin RdCVFL، يمكن نظريا منع فقدان الرؤية مخروط في جميع الأشكال الوراثية من RP¹⁶. لقد أظهرنا أن المنتج الجيني NXNL1، RdCVFL، يتم التعبير عنه في الثقافات المخصبة بمخروط الدجاج¹⁷ وحيث يلعب دورا وقائيا¹⁸. تم تحديد RdCVF وجين NXNL1 من خلال فحص محتوى عال من مكتبة cDNA الشبكية باستخدام بقاء الخلايا من ثقافة المخصب مخروط كما قراءات¹⁹. فحصنا ما يعادل 210،000 استنساخ فردي للمكتبة باستخدام 8 اختبارات موازية لكل استنساخ. وهذا يمثل عددا كبيرا جدا من الاختبارات التي تتطلب سهولة الوصول إلى المواد البيولوجية، وشبكية العين من أجنة الدجاج. وجدنا أنه كان من السهل نسبيا الحصول على بيض الدجاج الجنيني على أساس أسبوعي لأنها تنتج على نطاق واسع للصناعة الزراعية للدجاج الذي يضع البيض والدجاج المنتج للحوم. بعد التوحيد الدقيق للثقافات المخصبة بالمخروط ، يوفر النظام طريقة سهلة وقوية وقابلة للاستنساخ لاختبار آلاف الجزيئات لقدرتها على الحفاظ على صلاحية المخروط. هذه الخلايا هي أيضا قابلة للتلاعب الجيني²⁰ التي تستفيد من دراسة نقل إشارة والتحاليل الكيميائية الحيوية^21،22،23.

وقد وضعت الباحثين الشبكية أساليب بديلة كما استخدام خط الخلية مخروط 661W^24,25,26. ومع ذلك، فإن هوية هذا الخط الخلية لا تزال مثيرة للجدل^27،28. تم استنساخ الخلايا 661W من أورام الشبكية من خط الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن مستضد T SV40 كبيرة تحت السيطرة على الإنسان interphotoreceptor الريتينول ملزمة البروتين المروج. SV40 مستضد T كبيرة تتوسط التحول الخلوي والخلود. ونتيجة لذلك، يجب الإبلاغ عن مسار الإشارات المحدد باستخدام خلايا 661W في سياق خط الخلية المتحول والخالد الذي يختلف بطرق عديدة عن المخاريط في الموقع. في هذا الصدد، يتكون نظام الثقافة المخصب بالمخروط من الخلايا العصبية الأولية، والمخاريط التي هي أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية.

في حين أنه من الممكن الحصول على ثقافة نقية من المستقبلات الضوئية باستخدام قسم هزاز من شبكية العين الماوس، ونسبة منخفضة جدا من المخاريط في شبكية العين الخارجية من القوارض يجعل هذا النهج غير مناسب لإنتاج الثقافات المخصب^{مخروط 29}. شبكية العين خنزير لا يحتوي على fovea ولكن لديه منطقة تسمى centralis المنطقة التي يتم إثراء جدا في المخاريط³⁰. نسبة عالية من المخاريط في القوارض النهارية شبكية العين, كما Arvicanthis ansorgei وPsammomys obsesus^31,32, يقدم حلا ممكنا ولكن يتطلب تربية مثل هذه الأنواع الغريبة. يمكن استخدام عيون الخنازير البالغة ، التي تم جمعها من المسالخ المحلية ، لإنتاج ثقافة مختلطة من القضبان والمخاريط التي تم استخدامها لدراسة بقاء المستقبل الضوئي^33. حل أنيق هو قبل تنقية المخاريط من شبكية العين الخنزير باستخدام بالغسل مع الفول السوداني agglutinin (PNA) lectin، الذي يربط بشكل انتقائي إلى المخاريط³⁴. ومع ذلك، يصعب تنفيذ هذه الطريقة على نطاق واسع بسبب تعقيدها.

الخلايا الجذعية المستحثة بشريا (iPS) يقدم النهج الواعد للحصول على مخروط الخلايا مستقبلات ضوئية التي يمكن استخدامها لزرع الشبكية ولكن يمكن أيضا أن تتكيف مع ثقافة^{المخصب مخروط 35,36}. منذ عامل النسخ NRL مطلوب لقضبان مستقبلات^{ضوئية 37}، وNRL – / الماوس لديه شبكية العين التي تهيمن عليها المخاريط موجة قصيرة (S – المخاريط). ويمكن استخدام تعطيل لإنتاج S-مخروط المخصب إعداد عن طريق التمايز بين الإنسان من iPS^38,39. نهج آخر ممكن هو تعزيز التمايز مخروط باستخدام هرمون الغدة الدرقية^{إشارة 40}. في حين أن أساليب جديدة لإنتاج الثقافات المخصبة بالمخروط من iPS الإنسان آخذة في الظهور ، فإن أجنة الدجاج توفر طريقة مثبتة حاليا¹⁹.

كان للثقافة المخصبة بالمخروط دور فعال في تحديد RdCVF عن طريق استنساخ التعبير¹⁹. كما تم استخدام هذا النظام بنجاح لإثبات أن RdCVF يحفز امتصاص الجلوكوز والتمثيل الغذائي من خلال انحلال الجليكوليسيس^{الهوائية 22}. وعلاوة على ذلك تم استخدام الثقافة المخصبة بالمخروط للتحقق من صحة الدور الوقائي ل RdCVFL ، المنتج الثاني لجين NXNL1 ²³. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذا النظام لإثبات وجود جزيئات حماية تفرزها الخلايا الظهارية المصطبغة الشبكية التي تم نقلها مع OTX2⁴¹.