Summary

Caractérisation cytométrique en flux du développement des lymphocytes B murins

Published: January 22, 2021
doi:

Summary

Nous décrivons ici une analyse simple de l’hétérogénéité du compartiment des cellules B immunitaires murines dans le péritoine, la rate et les tissus de la moelle osseuse par cytométrie en flux. Le protocole peut être adapté et étendu à d’autres tissus de souris.

Abstract

Des études approfondies ont caractérisé le développement et la différenciation des cellules B murines dans les organes lymphoïdes secondaires. Les anticorps sécrétés par les lymphocytes B ont été isolés et développés en thérapies bien établies. La validation du développement des cellules B murines, dans le contexte de souris sujettes auto-immunes, ou chez des souris dont le système immunitaire est modifié, est un élément crucial du développement ou du test d’agents thérapeutiques chez la souris et constitue une utilisation appropriée de la cytométrie en flux. Des paramètres cytométriques en flux de cellules B bien établis peuvent être utilisés pour évaluer le développement des cellules B dans le péritoine murin, la moelle osseuse et la rate, mais un certain nombre de meilleures pratiques doivent être respectées. En outre, l’analyse cytométrique en flux des compartiments des cellules B devrait également compléter des lectures supplémentaires du développement des cellules B. Les données générées à l’aide de cette technique peuvent approfondir notre compréhension des modèles murins de type sauvage et sujets à tendance auto-immune ainsi que des souris humanisées qui peuvent être utilisées pour générer des anticorps ou des molécules semblables à des anticorps à titre thérapeutique.

Introduction

Les anticorps monoclonaux sont devenus de plus en plus la thérapie de choix pour de nombreuses maladies humaines à mesure qu’ils font partie de la médecine traditionnelle1,2. Nous avons déjà décrit des souris génétiquement modifiées qui produisent efficacement des anticorps hébergeant des régions variables entièrement humaines avec des constantes IgH de souris3,4. Plus récemment, nous avons décrit des souris génétiquement modifiées qui produisent des molécules semblables à des anticorps qui ont une liaison distincte à l’antigène5. Les anticorps sont sécrétés par les cellules B et forment la base de l’immunité humorale adaptative. Il existe deux types distincts de cellules B, B-1 et B-2. Chez les mammifères, les cellules B-1 proviennent du foie fœtal et sont enrichies dans les tissus muqueux et les cavités pleurales et péritonéales après la naissance, tandis que les cellules B-2 proviennent du foie fœtal avant la naissance et par la suite dans la moelle osseuse (BM). Les cellules B-2 sont enrichies dans les organes lymphoïdes secondaires, y compris la rate et le sang6,7,8. Dans le BM, les progéniteurs hématopoïétiques B-2 commencent à se différencier en cellules pro-B lors de l’initiation du réarrangement de la chaîne lourde Ig mu9,10. Le réarrangement réussi de la chaîne lourde Ig et son assemblage dans le récepteur des cellules pré-B (pré-BCR), ainsi que la signalisation et l’expansion proliférative, conduisent à la différenciation des cellules pré-B. Une fois que les cellules pré-B ont réarrangé leurs chaînes légères Ig kappa (Igκ) ou, si elles sont improductives, Ig lambda (Igλ), elles s’associent à μ chaîne lourde, ce qui entraîne une expression igM BCR de surface. Il est important de souligner que l’expression de surface des IgM est connue pour être réduite dans des conditions d’autoréactivité, contribuant ainsi à l’auto-tolérance dans les cellules B fonctionnellement insensibles ou anergiques11,12. Les lymphocytes B immatures entrent alors dans une phase de transition, où ils commencent à co-exprimer les IgD et à migrer du BM vers la rate. Dans la rate, l’expression des IgD augmente encore et les cellules mûrissent dans une deuxième étape de cellules B transitionnelles, suivie de l’achèvement de leur état de maturation et de leur développement en cellules de zone marginale (MZ) ou folliculaires (Fol)13,14,15. Chez les souris adultes, dans un environnement non malade, le nombre de cellules B matures reste constant malgré 10 à 20 millions de cellules B immatures générées quotidiennement dans le BM. Parmi ceux-ci, seulement trois pour cent entrent dans le pool de cellules B matures. La taille du compartiment périphérique des lymphocytes B est limitée par la mort cellulaire, due en partie à plusieurs facteurs, notamment l’autoréactivité et la maturation incomplète16,17,18. L’analyse cytométrique en flux a été largement utilisée pour caractériser et dénombrer de nombreux sous-compartiments de cellules immunitaires chez l’homme et la souris. Bien qu’il existe certaines similitudes entre les compartiments des cellules B humaines et murines, ce protocole ne s’applique qu’à l’analyse des cellules B murines. Ce protocole a été développé dans le but de phénotyper des souris génétiquement modifiées, afin de déterminer si la manipulation génétique modifierait le développement des cellules B. La cytométrie en flux a également été extrêmement populaire dans de nombreuses autres applications, notamment dans la mesure de l’activation cellulaire, de la fonction, de la prolifération, de l’analyse du cycle, de l’analyse du contenu de l’ADN, de l’apoptose et du tri cellulaire 19,20.

La cytométrie en flux est l’outil de choix pour caractériser divers compartiments lymphocytaires chez la souris et l’homme, y compris dans des organes complexes tels que la rate, le BM et le sang. En raison des réactifs d’anticorps spécifiques à la souris largement disponibles pour la cytométrie en flux, cette technique peut être utilisée pour étudier non seulement les protéines de surface cellulaire, mais aussi les phosphoprotéines intracellulaires et les cytokines, ainsi que les lectures fonctionnelles21. Nous démontrons ici comment les réactifs de cytométrie en flux peuvent être utilisés pour identifier les sous-ensembles de cellules B à mesure qu’ils mûrissent et se différencient dans les organes lymphoïdes secondaires. Après l’optimisation des conditions de coloration, la manipulation des échantillons, la configuration correcte de l’instrument et l’acquisition des données, et enfin l’analyse des données, un protocole d’analyse cytométrique en flux complète du compartiment des cellules B chez la souris peut être utilisé. Une telle analyse complète est basée sur une nomenclature vieille de plusieurs décennies conçue par Hardy et ses collègues, où le développement de cellules BM B-2 peut être divisé en différentes fractions (Fraction) en fonction de leur expression de B220, CD43, BP-1, CD24, IgM et IgD22. Hardy et al., ont montré que les cellules B B CD220+ CD43 peuvent être subdivisées en quatre sous-ensembles (Fraction A-C’) sur la base de l’expression BP-1 et CD24 (30F1), tandis que les cellules B BM B 220+ (dim to neg) peuvent être résolues en trois sous-ensembles (Fraction D-F) basés sur l’expression différentielle des IgD et des IgM23 de surface. La fraction A (cellules pré-pro-B) est définie comme BP-1-CD24 (30F1), la fraction B (cellules pro-B précoces) est définie comme BP-1-CD24 (30F1)+, la fraction C (cellules pro-B tardives) est définie comme BP-1+ CD24 (30F1)+, et la fraction C'(cellules pré-B précoces) est définie comme BP-1+ et CD24high. En outre, la fraction D (cellules pré-B) est définie comme des cellules B220+ CD43-IgM-B, et la fraction E (cellules B nouvellement générées, combinaison de cellules immatures et transitionnelles) est définie comme des cellules B B B220+ CD43 IgM+ et la fraction F (cellules B matures et recirculantes) est définie comme des cellules B B B220high CD43 IgM+. En revanche, la majorité des lymphocytes B naïfs présents dans la rate peuvent être divisés en cellules B matures (B220+ CD93) et cellules transitionnelles (T1, T2, T3) en fonction de l’expression de CD93, CD23 et IgM. Les cellules B matures peuvent être résolues en sous-ensembles marginaux et folliculaires basés sur l’expression des IgM et des CD21/CD35, et les sous-ensembles folliculaires peuvent être divisés en sous-ensembles folliculaires matures de type I et folliculaires de type II B en fonction du niveau de leur expression de surface IgM et IgD24. Ces populations de lymphocytes B spléniques expriment principalement la chaîne légère Igκ. Enfin, les populations de cellules B-1 B, qui proviennent du foie fœtal et se trouvent principalement dans les cavités péritonéales et pleurales de souris adultes, ont été décrites dans la littérature. Ces lymphocytes B péritonéaux peuvent être distingués des lymphocytes B-2 décrits précédemment par leur manque d’expression de CD23. Ils sont ensuite subdivisés en populations B-1a ou B-1b, la première étant définie par la présence de CD5 et la seconde par son absence25. Les progéniteurs des cellules B-1 sont abondants dans le foie fœtal, mais ne se trouvent pas chez le BM adulte. Bien que les cellules B-1a et B-1b proviennent de différents progéniteurs, elles ensemencent toutes deux les cavités péritonéale et pleurale24. Contrairement aux cellules B-2, les cellules B-1 sont uniquement capables de s’auto-renouveler et sont responsables de la production d’anticorps IgM naturels.

Des défauts dans le développement des lymphocytes B peuvent survenir dans de nombreux cas, y compris des déficiences dans les composants du BCR26,27, des perturbations des molécules de signalisation qui ont un impact sur la force de signalisation BCR14,28,29, ou une perturbation des cytokines qui modulent la survie des lymphocytes B30,31 . L’analyse par cytométrie en flux des compartiments lymphoïdes a contribué à la caractérisation des blocs de développement des cellules B chez ces souris et bien d’autres. L’un des avantages de l’analyse cytométrique en flux des compartiments lymphoïdes est qu’elle offre la possibilité d’effectuer des mesures sur des cellules individuelles obtenues à partir de tissus dissociés vivants. La disponibilité de réactifs dans une gamme sans cesse croissante de fluorophores permet l’analyse simultanée de plusieurs paramètres et permet d’évaluer l’hétérogénéité des cellules B. En outre, le dénombrement des cellules B par analyse cytométrique en flux complète d’autres tests immunologiques tels que les méthodes d’immunohistochimie qui visualisent la localisation cellulaire dans les organes lymphoïdes, la détection des niveaux d’anticorps circulants comme mesure de l’immunité humorale, ainsi que la microscopie à deux photons pour mesurer les réponses des cellules B dans l’espace et le temps réels32.

Protocol

Toutes les études sur la souris ont été supervisées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de Regeneron. L’expérience a été menée sur des tissus de trois souris femelles C57BL / 6J (âgées de 17 semaines) de Jackson Laboratories. Titrer tous les anticorps avant de commencer l’expérience pour déterminer la concentration idéale. Lorsque vous utilisez des perles de compensation pour une compensation unicolore, assurez-vous qu’elles tachent aussi brillan…

Representative Results

Nous présentons ici la stratégie de contrôle pour caractériser le développement des cellules B dans le péritoine, le BM et la rate de souris. La base de l’analyse est formée autour du concept de coloration avec un colorant de viabilité, puis de griller des doublets en fonction de la zone de diffusion avant (FSC-A) et de la hauteur de diffusion avant (FSC-H), et enfin de la rétention des débris en sélectionnant les cellules en fonction de leurs caractéristiques FSC-A et SSC-A…

Discussion

L’analyse cytométrique en flux des tissus lymphoïdes et non lymphoïdes a permis l’identification et le dénombrement simultanés des sous-populations de cellules B chez la souris et l’homme depuis les années 1980. Il a été utilisé comme mesure de l’immunité humorale et peut être appliqué davantage pour évaluer la fonctionnalité des cellules B. Cette méthode tire parti de la disponibilité des réactifs pour évaluer les différentes étapes de la maturation des lymphocytes B chez la souris et l’hom…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Matthew Sleeman pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également les départements Vivarium Operations et Flow Cytometry Core de Regeneron pour leur soutien à cette recherche.

Materials

0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes Eppendorf  22363611 0.5 mL microcentrifuge tube
1.5mL Eppendorf tubes  Eppendorf  22364111 1.5 mL microcentrifuge tube
15 mL Falcon tubes  Corning  352097 15 mL conical tube
18 gauge needle BD 305196
25 gauge needle BD  305124
3 mL syringe BD 309657
70 mM MACS SmartStrainer  Miltenyi Biotec  130-110-916  70 mM cell strainer
96 well U bottom plate  VWR 10861-564
ACK lysis buffer  GIBCO  A1049201 red blood cell lysis buffer
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate Pall Corporation 8027 filter plate
B220 eBiosciences 17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ BD 552843 compensation beads
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ BD 552844 compensation beads
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich  A8577 BSA
BP-1 BD 740882
Brilliant Stain Buffer BD 566349 brilliant stain buffer
C-Kit BD 564011
CD11b BD 563168
CD11b BioLegend 101222
CD19 BD 560143
CD21/35 BD 562756
CD23  BD 740216
CD24 (HSA) BioLegend 138504
CD3 BD 561388
CD3 BioLegend 100214
CD43 BD 553270
CD43 BioLegend 121206
CD5 BD 563194
CD93 BD 740750
CD93 BioLegend 136504
DPBS (1x) ThermoFisher 14190-144 DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 ThermoFisher 65-0866-14 viability dye
Extended Fine Tip Transfer Pipette Samco 233 disposable transfer pipette
FACSymphony A3 flow cytometer BD custom order flow cytometer
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) BD 553142 Fc block
FlowJo Flowjo flow cytometer analysis software
gentleMACS C Tubes  Miltenyi Biotec  130-096-334 automated dissociation tube 
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters  Miltenyi Biotec  130-095-937 tissue dissociator instrument
GR1 (Ly6C/6G) BioLegend 108422
IgD BioLegend 405710
IgM eBiosciences 25-5790-82
Kappa BD 550003
Lambda BioLegend 407308
paraformaldehyde, 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714
Ter119 BioLegend 116220
True-Stain Monocyte Blocker BioLegend 426103 monocyte blocker
UltraPure EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 15575038 EDTA
Vi-CELL XR Beckman Coulter 731050 cell counter instrument 

Referências

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Harris, F. M., Meagher, K. A., Zhong, M., Daniel, B. J., Eckersdorff, M., Green, J. A., Voronina, V., Guo, C., Limnander, A., Macdonald, L. E. Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development. J. Vis. Exp. (167), e61565, doi:10.3791/61565 (2021).

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