تدفق توصيف القياسات الخلوية من مورين B تطوير الخلية

أصبحت الأجسام المضادة أحادية النسيلة على نحو متزايد العلاج الاختياري للعديد من الأمراض البشرية لأنها تصبح جزءا من الطب ^{السائد1،2}. لقد سبق لنا أن وصف الفئران المعدلة وراثيا التي تنتج بكفاءة الأجسام المضادة التي تؤوي مناطق متغيرة بشرية بالكامل مع ثوابت IgH ^{الماوس3،4}. في الآونة الأخيرة ، وصفنا الفئران المعدلة وراثيا التي تنتج جزيئات تشبه الأجسام المضادة التي لها مستضد ملزم ^متميز5. وتفرز الأجسام المضادة من قبل الخلايا B وتشكل أساس الحصانة الفكاهية التكيفية. هناك نوعان متميزان من الخلايا B، B-1 و B-2. في الثدييات ، تنشأ خلايا B-1 في كبد الجنين وتثري في الأنسجة المخاطية والتجاويف الجنبية والبريتونية بعد الولادة ، في حين تنشأ خلايا B-2 في كبد الجنين قبل الولادة وبعد ذلك في نخاع العظام (BM). يتم إثراء خلايا B-2 في الأعضاء اللمفاوية الثانوية بما في ذلك الطحال ^{والدم6,7,8}. في BM، يبدأ السلف الدموي B-2 في التفريق إلى الخلايا الموالية ل B عند بدء إعادة ترتيب سلسلة Ig mu ^{الثقيلة9,10}. إعادة ترتيب ناجحة من سلسلة Ig الثقيلة وتجميعها في مستقبلات الخلية ما قبل B (قبل BCR)، جنبا إلى جنب مع الإشارات والتوسع التكاثري، يؤدي إلى التمايز إلى خلايا ما قبل B. بعد خلايا ما قبل B إعادة ترتيب كابا Ig (Igκ)، أو إذا كانت غير منتجة، Ig lambda (Igλ) سلاسل الضوء، فإنها زوج مع μ سلسلة ثقيلة، مما أدى إلى التعبير السطحي IgM BCR. من المهم الإشارة إلى أن التعبير السطحي IgM معروف بأنه ينخفض في ظل ظروف النشاط التلقائي ، مما يساهم في تحمل الذات في الخلايا B غير المستجيبة وظيفيا أو التحسسية ^11،12. ثم تدخل الخلايا B غير الناضجة مرحلة انتقالية ، حيث تبدأ في التعبير المشترك عن IgD والهجرة من BM إلى الطحال. في الطحال ، يزيد تعبير IgD أكثر وتنضج الخلايا إلى مرحلة ثانية من الخلايا B الانتقالية ، يليها الانتهاء من حالة نضجها وتطورها إلى إما منطقة هامشية (MZ) أو خلايا الجريبية (Fol) ^13،14،15. في الفئران البالغة ، في بيئة غير مريضة ، لا يزال عدد الخلايا B الناضجة ثابتا على الرغم من توليد 10-20 مليون خلية B غير ناضجة يوميا في BM. من هذه، ثلاثة في المئة فقط تدخل بركة من الخلايا B ناضجة. حجم مقصورة الخلية الطرفية B مقيد بموت الخلية، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدة عوامل بما في ذلك التفاعل الذاتي والنضج غير المكتمل16,17,18. وقد استخدم تحليل التدفق الخلوي على نطاق واسع لتوصيف وعدد العديد من المقصورات الفرعية للخلايا المناعية في البشر والفئران. في حين أن هناك بعض أوجه التشابه بين الإنسان ومقصورات الخلية B مورين، ينطبق هذا البروتوكول فقط على تحليل خلايا مورين B. تم تطوير هذا البروتوكول بهدف كتابة الفئران المعدلة وراثيا ، لتحديد ما إذا كان التلاعب الجيني سيغير تطور الخلية B. كما كان قياس التدفق الخلوي شائعا بشكل كبير في العديد من التطبيقات الإضافية ، بما في ذلك في قياس تنشيط الخلية ، والوظيفة ، والانتشار ، وتحليل الدورة ، وتحليل محتوى الحمض النووي ، وموت الخلايا المبرمج وفرز الخلايا ¹⁹²⁰.

قياس التدفق الخلوي هو الأداة المفضلة لتوصيف مختلف مقصورات الخلايا الليمفاوية في الفئران والبشر ، بما في ذلك في الأعضاء المعقدة مثل الطحال ، BM والدم. نظرا لواشف الأجسام المضادة الخاصة بالماوس المتاحة على نطاق واسع لقياس التدفق الخلوي ، يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق ليس فقط في البروتينات السطحية للخلايا ولكن أيضا البروتينات الدهنية داخل الخلايا والسيتوكينات ، وكذلك ^readouts21 الوظيفية. هنا نحن نبين كيف يمكن استخدام كاشفات قياس التدفق الخلوي لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا B عند نضجها والتمييز في الأعضاء اللمفاوية الثانوية. بعد التحسين الأمثل لظروف تلطيخ، والتعامل مع العينات، وإعداد الصك الصحيح والحصول على البيانات، وأخيرا تحليل البيانات، يمكن استخدام بروتوكول لتحليل التدفق الخلوي الشامل لمقصورة الخلية B في الفئران. ويستند هذا التحليل الشامل على تسمية عقود من العمر وضعت من قبل هاردي وزملاؤه، حيث يمكن تقسيم تطوير خلايا BM B-2 إلى كسور مختلفة (كسر) اعتمادا على تعبيرهم عن B220، CD43، BP-1، CD24، IgM ^وIgD22. هاردي وآخرون، أظهرت أن B220 ⁺ CD43 BM B الخلايا يمكن تقسيمها إلى أربع مجموعات فرعية (كسر A-C’) على أساس BP-1 و CD24 (30F1) التعبير، في حين B220⁺ CD43^{-(dim to neg)} BM B الخلايا يمكن حلها في ثلاث مجموعات فرعية (كسر D-F) على أساس التعبير التفاضلي من IgD وسطح ^IgM23. يتم تعريف الكسر A (خلايا ما قبل pro-B) على أنه BP-1^– CD24 (30F1)^–، يتم تعريف الكسر B (الخلايا المؤيدة ل B المبكرة) على أنه BP-1^– CD24 (30F1)⁺، ويتم تعريف الكسر C (الخلايا المتأخرة المؤيدة ل B) على أنه BP-1⁺ CD24 (30F1)⁺، ويتم تعريف الكسر C (خلايا ما قبل B المبكرة) على أنه BP-1⁺ وCD24high. وعلاوة على ذلك، يتم تعريف الكسر D (خلايا ما قبل B) على أنه خلايا B220⁺ CD43^{– IgM-B}، ويتم تعريف الكسر E (الخلايا B التي تم إنشاؤها حديثا، والجمع بين الخلايا غير الناضجة والانتقالية) على أنه خلايا B220⁺ CD43^– IgM⁺ B والكسر F (الخلايا B الناضجة المعاد تدويرها) على أنها خلايا B220high CD43^– IgM⁺ B. في المقابل، يمكن تقسيم غالبية الخلايا B السذاجة الموجودة في الطحال إلى خلايا B ناضجة (B220⁺ CD93^–) وخلايا انتقالية (T1، T2، T3) اعتمادا على التعبير عن CD93 و CD23 و IgM. يمكن حل الخلايا B الناضجة إلى مناطق هامشية ومجموعات فرعية جريبية استنادا إلى التعبير عن IgM و CD21/CD35 ، ويمكن تقسيم المجموعات الفرعية الجريبية إلى نوع جريبي ناضج I ومجموعات فرعية من النوع B الجريبي اعتمادا على مستوى التعبير السطحي IgM و ^IgD24. هذه المجموعات الخلية B splenic التعبير عن سلسلة الضوء في الغالب Igκ. وأخيرا، تم وصف مجموعات خلايا B-1 B، التي تنشأ في كبد الجنين وتوجد بشكل رئيسي في التجاويف الصفاقية والجنبية للفئران البالغة، في الأدبيات. يمكن تمييز هذه الخلايا البريتونية B من الخلايا B-2 B الموصوفة سابقا بسبب افتقارها إلى تعبير CD23. ثم يتم تقسيمها إلى مجموعات B-1a أو B-1b ، مع تعريف الأول بوجود CD5 والثاني ^{بغيابه25}. سلفات الخلايا B-1 وفيرة في كبد الجنين، ولكن لا توجد في BM الكبار. في حين أن خلايا B-1a و B-1b تنشأ من أسلاف مختلفين ، إلا أنهما تزرعان التسوس البريتوني ^{والبليبي24}. وعلى النقيض من خلايا B-2، فإن خلايا B-1 قادرة بشكل فريد على التجديد الذاتي ومسؤولة عن إنتاج الأجسام المضادة الطبيعية IgM.

يمكن أن تنشأ عيوب في تطور الخلية B في كثير من الحالات، بما في ذلك أوجه القصور في مكونات ^BCR26،27، اضطرابات جزيئات الإشارات التي تؤثر على BCR قوة ^{الإشارة14،28،29}، أو تعطيل السيتوكينات التي تعدل بقاء الخلية ^B30،31 . وقد ساهم تحليل تدفق قياس الخلايا من مقصورات اللمفاوية في توصيف كتل تطوير الخلية B في هذه الفئران وغيرها الكثير. ميزة واحدة من تحليل تدفق الخلايا من مقصورات اللمفاوية هو أنه يوفر القدرة على إجراء قياسات على الخلايا الفردية التي تم الحصول عليها من الأنسجة الحية منفصلة. ويتيح توافر الكواشف في نطاق متوسع من الفلوروفوريس إجراء تحليل متزامن لمعلمات متعددة ويمكن من تقييم عدم تجانس الخلايا باء. وعلاوة على ذلك، فإن تعداد الخلايا B عن طريق تحليل التدفق الخلوي يكمل المقايسات المناعية الأخرى مثل أساليب الكيمياء المناعية التي تصور توطين الخلايا داخل الأعضاء اللمفاوية، والكشف عن مستويات الأجسام المضادة المتداولة كمقياس للمناعة الفكاهية، فضلا عن اثنين من المجهر الفوتون لقياس استجابات الخلية B في المكان الحقيقي ^{والوقت32}.