O protocolo aqui apresentado fornece informações sobre o eletroencefalograma (EEG) simultâneo e avaliação comportamental em tempo real. Discutimos todas as etapas envolvidas neste protocolo como uma solução atraente para pesquisadores em muitos campos da neurociência, particularmente nas áreas de aprendizagem e memória.
A amplitude das ondas cerebrais obtidas a partir da eletroencefalografia (EEG) tem sido bem reconhecida como base para a capacidade cognitiva, memória e aprendizagem em animais e humanos. O mecanismo de neurogênese do adulto também está ligado à melhora da memória e da aprendizagem. Tradicionalmente, os pesquisadores costumavam avaliar parâmetros de aprendizagem e memória em modelos de roedores por meio de tarefas comportamentais. Portanto, o monitoramento simultâneo de mudanças comportamentais e EEG é particularmente interessante na correlação de dados entre atividade cerebral e comportamentos relacionados à tarefa. No entanto, a maioria dos equipamentos necessários para a realização de ambos os estudos ou são complexos, caros ou utilizam uma rede de instalação cabeada que dificulta o movimento natural dos animais. Neste estudo, o EEG foi registrado com um dispositivo de eletrofisiologia sem fio juntamente com a execução de uma nova tarefa de reconhecimento de objetos (NORT). O comportamento do animal foi monitorado simultaneamente por um sistema de rastreamento de vídeo. Ambos os registros foram analisados off-line por seus carimbos de data/hora que foram sincronizados para vincular os sinais de EEG com as ações do animal. Os indivíduos consistem em ratos Wistar adultos após tratamento de enriquecimento ambiental a médio prazo. Seis eletrodos de parafuso craniano foram fixados aos pares em ambos os hemisférios nas regiões frontal, central e parietal e referenciados a um eletrodo localizado posteriormente ao osso nasal. O protocolo NORT consiste em expor o animal a dois objetos idênticos por 10 min. Após 2 h e 24 h, um dos objetos foi substituído por um novo. O tempo de exploração de cada objeto foi monitorado por um software de rastreamento comportamental (BTS) e registro dos dados do EEG. A análise do EEG sincronizado com dados comportamentais consiste em estimativas de potência de banda relativa alfa e beta e comparações entre reconhecimento de objetos novos versus exploração de objetos familiares, entre três etapas experimentais. Neste manuscrito, discutimos o processo de fabricação dos eletrodos, a cirurgia de implante de eletrodos peridurais, o protocolo de enriquecimento ambiental, o protocolo NORT, a configuração BTS, o acoplamento EEG-BTS para monitoramento simultâneo em tempo real e a análise de dados de EEG baseada na detecção automática de eventos.
O teste comportamental é crucial na pesquisa em neurociência para uma grande quantidade de informação gerada em um contexto in vivo. Nesse sentido, pesquisadores têm utilizado amplamente diferentes testes comportamentais para analisar a função sensório-motora, as interações sociais, o comportamento ansioso e depressivo, a dependência de substâncias e as diversas formas de funções cognitivas1. O registro manual de testes comportamentais pode ser difícil, exaustivo e impreciso mesmo para a maioria dos observadores experientes. Embora alguns esforços tenham sido feitos para desenvolver softwares livres e de código aberto para registro de comportamento (por exemplo, aplicativo sexrat male2 para comportamento sexual), várias alternativas permitem o registro comportamental automático e em tempo real de diferentes espécies animais, desde peixes3 até roedores 4,5,6. O rastreamento de vídeo é um método valioso para a gravação rápida e precisa do comportamento usado em uma ampla variedade de aplicações7. Uma característica mais potencial na área de registro comportamental é explorar a atividade neural durante a manifestação comportamental. O registro simultâneo da atividade neuronal (de células isoladas para as principais áreas cerebrais) e tarefas comportamentais poderia nos mostrar como o cérebro gera padrões comportamentais específicos8. Comportamentos são uma sequência de componentes menores que podem revelar correlatos entre a atividade neural e movimentos ou ações. Se a atividade neuronal e os padrões comportamentais pudessem ser registrados simultaneamente por meio de várias escalas de tempo, eles poderiam explicar como cada estado cerebral se correlaciona com cada comportamento particular (para um exame mais aprofundado do registro comportamental, ver Datta et al., revisão8 de 2019). Portanto, o registro sincronizado da atividade comportamental e neuronal na escala desejada (de neurônios a grandes áreas do cérebro) é considerado uma ferramenta extremamente útil. Existem vários sistemas destinados a integrar registros comportamentais com outras medidas como a atividadeneural4,5.
Embora a eletroencefalografia seja considerada uma das técnicas mais utilizadas no campo da neurociência clínica e de pesquisa, a mobilidade relativamente alta, bem como o tamanho do aparelho de registro de EEG, torna essa técnica única e desafiadora para detecção em modelos invivo9. Algumas soluções para esse problema foram desenvolvidas, por exemplo, o uso de cabos e dispositivos giratórios que permitem que os animais se movam livremente na arena. No entanto, os sistemas baseados em cabos muitas vezes impõem problemas para a realização de estudos, por exemplo, durante a transferência de um animal de uma gaiola para outra, observa-se impedimento ou emaranhamento do animal com os cabos. Dispositivos telemétricos foram desenvolvidos para registros eletrofisiológicos sem fio para aumentar a flexibilidade da situação de registro10,11. No entanto, tais sistemas têm mostrado limitações consideráveis devido ao seu baixo número de canais de gravação e baixas taxas de amostragem11. Neste estudo, foi utilizado um sistema sem fio disponível comercialmente que envia sinais de EEG do animal através de uma conexão Wi-Fi com um sistema de roedores em movimento livre12. O aparelho pesa 6 gramas e suporta até 16 canais gravados a 1 kSps. Este sistema permite o registro de EEG ou spike no ambiente animal, com uma perturbação reduzida, servindo como uma solução econômica em comparação com os sistemas eletrofisiológicos tradicionais no mercado. Além disso, sincronizamos esses dados usando um software de rastreamento de vídeo para fornecer correlação entre EEG e padrões comportamentais. Essa sincronização é feita off-line por alinhamento e interpolação de dados e eventos com base em carimbos de data/hora gerados por ambos os sistemas e é processada no MATLAB.
A neurogênese do adulto é definida como a proliferação, sobrevivência e diferenciação em neurônios de células recém-geradas no giro denteado de animais13,14. Sabe-se que esse processo está associado à melhora da memória e do aprendizado, o que aumenta a neurogênese adulta em roedores por meio de condições de ambiente enriquecido (EE)15. A EE consiste em alojar roedores em pequenos grupos dentro de uma grande gaiola provida de brinquedos e tubos, onde os animais apresentam relevância biológica nova e complexa, mas sem relevância biológica15. Embora o EE estimule a neurogênese hipocampal, ele também varia em muitos fatores, como idade, tensão animal, condições específicas de estimulação ou procedimento de detecção da neurogênese. Em camundongos de meia-idade expostos ao alojamento de EE por sete dias, o nascimento de novas células granulares (GC) no giro denteado (GD) hipocampal foi relatado16. Estudos tentando ablar seletivamente a neurogênese adulta em ratos adultos têm sugerido que novas células granulares de cerca de 1 a 2 semanas de idade são necessárias na resposta aprendida17. Por volta de 2 ou 3 semanas após o nascimento do CG no adulto GD, várias características como espinhos dendríticos, essenciais para a transmissão sinápticaexcitatória18, começam a aparecer. realizaram uma análise quantitativa para mostrar que o pico de crescimento da coluna ocorre durante as primeiras 3 a 4 semanas19. Vários estudos eletrofisiológicos in vivo sugerem que apenas três semanas de condições de alojamento do EE produzem alterações na transmissão sináptica do GD e aumentam a excitabilidade celular20. Além disso, foi relatado que a exposição a um ambiente enriquecido em 1-4 semanas após injeções de BrdU aumentou significativamente a densidade de células BrdU/NeuN na camada granular de DG em camundongos21. Esses autores sugerem que existe um período crítico entre uma e três semanas após a exposição ao EE, uma vez que foi observado um aumento substancial no número de novos neurônios21. Estudos da neurogênese hipocampal adulta (NHA) em humanos têm sido controversos, uma vez que não há evidências diretas. No entanto, um relato recente descreveu os estágios de desenvolvimento da AHN no cérebro humano adulto, identificando milhares de neurônios imaturos no GD e, assim, demonstrando a importância da AHN durante o envelhecimento em humanos22. Com base nas evidências mencionadas anteriormente, o estudo do AHN em modelos animais é mais importante do que nunca (para um exame mais aprofundado do AHN, ver Leal-Galicia et al., revisão de 201915).
Como mencionado anteriormente, o hipocampo tem sido associado a uma função fundamental nas capacidades de aprendizagem e memória. A formação das memórias passa por três processos distintos: codificação (aquisição da memória), consolidação (armazenamento da memória) e recuperação (reconhecimento da memória)23. A memória de reconhecimento em humanos é testada por meio da tarefa de comparações pareadas visuais24. Os fundamentos dos modelos humanos e animais de memória e amnésia são os testes comportamentais que avaliam a capacidade de reconhecer um estímulo previamenteapresentado25,26, como a tarefa de comparações visuais pareadas em humanos. Portanto, um dos testes comportamentais mais utilizados para avaliar a habilidade de um roedor em reconhecer um estímulo previamente apresentado, ou seja, a capacidade de aprendizagem e memória é a tarefa de reconhecimento de objetos novos espontâneos (NORT)23,27. O protocolo NORT consiste em dois objetos novos idênticos em uma arena familiar por 10 min no ensaio de aquisição. Após um tempo específico entre 0,28 e 48 horas29 (tempo variável de acordo com cada protocolo), o animal é devolvido à mesma arena contendo um dos mesmos objetos familiares e um objeto novo. O animal explora espontaneamente o objeto novo se o objeto familiar foi memorizado26. A razão de preferência é comumente usada na avaliação do desempenho exploratório. É determinado dividindo o tempo total de exploração do objeto do tempo de exploração do objeto novo ou familiar. O NORT tem algumas vantagens sobre outros testes de memória de reconhecimento. Mais importante ainda, não requer motivação externa, recompensa ou punição. Não gera condições estressantes. Finalmente, nenhum treinamento é necessário para evocar o comportamento de explorar os objetos (para um exame mais aprofundado da NORT, ver ref.23).
Portanto, o registro simultâneo de múltiplas modalidades de dados e sua integração no estudo da aprendizagem e da memória, como efeito da neurogênese hipocampal do adulto, é altamente atraente e fornece uma solução atraente para os pesquisadores da área. O presente trabalho irá expor todos os processos envolvidos na avaliação simultânea de vídeo-rastreamento comportamental (nova tarefa de reconhecimento de objetos) e gravação eletroencefalográfica sem fio. Aqui revisamos o processo de fabricação de eletrodos, cirurgia de implante de eletrodos peridurais (parafuso craniano), protocolo de enriquecimento ambiental (para indução da neurogênese hipocampal), seguindo protocolo NORT, configuração BTS, acoplamento EEG – BTS para monitoramento simultâneo em tempo real, e EEG e análise de dados comportamentais executados em ambiente computacional MATLAB.
A pesquisa comportamental e eletroencefalográfica é difícil e desafiadora por natureza. Portanto, a combinação das duas técnicas apresenta etapas críticas significativas. Assim, ambas as técnicas concomitantes são pouco utilizadas. Na prática real, todos os grupos ao redor do mundo realizam testes comportamentais com condições especiais, como animais, parâmetros analisados ou tratamentos. O exposto gera controvérsias significativas na área e a necessidade de desenvolvimento de procedimentos padronizados disponíveis para todos. Aqui, preparamos este procedimento detalhado com todas as etapas críticas e considerações metodológicas que não são usualmente descritas ou mencionadas na maioria dos artigos publicados. Estes são discutidos abaixo.
A produção dos materiais necessários é um passo fundamental para o sucesso dessa técnica. Nesse sentido, o eletrodo precisa ser construído do zero usando parafusos de aço inoxidável, cabos de cobre e soldador de prata. Estes materiais são difíceis de soldar permanentemente, de tal forma que a condutividade e a resistência de cada eletrodo devem ser verificadas antes do uso. É possível utilizar outro tipo de fio para a montagem do eletrodo; no entanto, o cobre é flexível o suficiente para manipular o eletrodo para inseri-lo no conector do amplificador. Nesse sentido, o uso de eletrodos comerciais é desejável, mas sua aquisição pode ser complicada e cara. A cirurgia é uma das etapas mais críticas desse protocolo. É altamente recomendado e até mesmo necessário ter um cirurgião experiente, particularmente para o implante de eletrodos. Como a cirurgia frequentemente requer o prolongamento do tempo de anestesia e, às vezes, uma aplicação de soldagem durante a cirurgia, cada laboratório deve realizar os testes necessários com a anestesia apropriada (diferentes coquetéis podem ser usados) para cada cepa de roedores, particularmente em condições de biotério, diferenças entre ninhadas e até mesmo diferenças individuais entre animais. Planejamento e consideração adequados poderiam evitar a perda de animais durante as cirurgias. A implantação dos eletrodos é outro passo crucial. Requer muito cuidado para evitar perfurar o crânio e danificar meninges ou tecido cerebral. Os parafusos devem ser colocados corretamente, ou seja, completamente fixados no crânio, caso contrário, ruídos e artefatos estarão presentes nos sinais, como aqueles relacionados a uma péssima colocação ou movimento que não utiliza o registro do EEG. O tratamento e as condições pré e pós-operatórias devem ser sempre realizados e observados para evitar o sofrimento do roedor. A lidocaína subcutânea pode ser usada na pele da cabeça antes de fazer a incisão com o bisturi. Uma gota de soro fisiológico nos olhos do animal ajudará a evitar o ressecamento. Além disso, uma solução salina deve ser administrada na boca e, após a cirurgia, 1 mL deve ser administrado por via subcutânea ou intraperitoneal para compensar o balanço hídrico do animal e evitar a desidratação. Imediatamente após a cirurgia, um medicamento anti-inflamatório (para reduzir a dor), bem como antibióticos via subcutâneo ou tópicos, devem ser administrados diretamente na periferia do couro cabeludo onde a tampa de cimento dental está localizada (para diminuir a probabilidade de infecção). Repita o procedimento acima 24 h após a cirurgia. O posicionamento do amplificador de EEG no dorso do animal é a principal dificuldade para o registro simultâneo. O design e a fabricação de um colete são especificamente baseados no tamanho dos animais. O colete deve permitir o movimento natural do roedor (ver Figura 5). Este último garantirá a principal vantagem da técnica, que é o registro dos movimentos livres. Como os animais não tentaram retirar o colete, o conector da cabeça ou os cabos após a cirurgia e nos dias subsequentes, presumiu-se que a instalação não gerou restrição de movimento significativa ou causou dor ou desconforto. Para uma correta segmentação do EEG em épocas com base em eventos marcados pela SBPT é obrigatório anotar um protocolo bem definido. As marcas temporárias podem ser mescladas por manipulação de séries temporais porque ambos os sistemas usam o mesmo relógio para configurar seus carimbos de data/hora. O exposto amplia as possibilidades de experimentação animal incorporando dados eletrofisiológicos para análise.
A técnica aqui apresentada pode ser utilizada em qualquer área de pesquisa em neurociência e com as espécies murinas mais comuns e até mesmo outras espécies. A versatilidade do Software de Rastreamento Comportamental é uma das vantagens mais significativas, uma vez que ele poderia ser usado em uma grande versatilidade de labirintos como labirinto aquático Morris, campo aberto, reconhecimento de novos objetos, preferência de lugar condicionado, placa de buraco, labirinto em cruz elevado, labirinto em Y, labirinto de braço radial, labirinto de Barnes, e outros. Pode ser usado até 16 câmeras simultaneamente. Além disso, centenas de medidas diferentes (para informações mais detalhadas ver manuais31,32) podem ser relatadas. Considere que este trabalho descreve a experimentação para registros de EEG, algumas outras técnicas como Potenciais de Campos Locais ou registro de unidade única são possíveis. No entanto, os usuários devem considerar que a configuração geral e várias etapas preparatórias precisam mudar para outros fins. Assim, quando essa técnica é utilizada em conjunto com o registro Wi-Fi do EEG, as possibilidades são ampliadas, pois agrega novas perspectivas a estudos em animais, como os realizados em seres humanos, para avaliar diversas características da integração e dinâmica do EEG, como conectividade, potência da banda do EEG ou respostas evocadas. Ao contrário dos seres humanos, a experimentação animal é possível para avaliar a administração de medicamentos, modificações gênicas ou expressão, entre muitos outros paradigmas experimentais. Para a análise do EEG, considere que alguns protocolos apresentam um número muito baixo de repetições dos comportamentos desejados, o que restringe a possibilidade de médias de respostas e obtenção de resultados confiáveis. Portanto, tenha o cuidado de elaborar os protocolos de gravação e análise que se considera realizar antes de iniciar o experimento. No entanto, deve-se considerar que trabalhar em experimentação animal não é possível impedir o movimento, aumentando a complexidade do protocolo experimental e considerações para análise de sinais e tarefas comportamentais. Atualmente, os equipamentos para sistemas completos de rastreamento e registros de EEG não são padronizados ou modulares, o que significa que sua montagem se destina a um único protocolo e adaptações para explorar outras tarefas comportamentais, implicando/sugerindo maiores custos para um grande número de laboratórios. Essa situação poderia ser resolvida seguindo as opções explicadas neste estudo. No entanto, várias melhorias puderam ser realizadas para experimentos mais confiáveis. O trabalho pode ser aprimorado em várias etapas, desde a fabricação dos eletrodos até o processamento comportamental e de sinais. No entanto, é demonstrado que o rastreamento de animais e a aquisição de EEG são possíveis usando uma configuração de alta tecnologia acessível, mas barata.
Em resumo, o presente trabalho é uma tentativa de ajudar os cientistas, particularmente no campo das neurociências, a serem capazes de usar essas duas técnicas que não são comumente usadas em combinação. A técnica de registro simultâneo de EEG e testes comportamentais usando o Software de Rastreamento Comportamental tem muitas vantagens, e pode ser particularmente útil em muitos campos da Neurociência, particularmente nas áreas de aprendizagem e memória. Considerando que este equipamento possui outras capacidades como um registro profundo de estruturas subcorticais como o hipocampo, mas como mencionado, várias etapas preparatórias irão mudar. O equipamento sem fio resolve quase todas as limitações de uma abordagem de fio convencional, como problemas de mobilidade dos animais de uma gaiola para outra, animais impedidos ou emaranhados com os cabos. Esta técnica de configuração é fácil de usar, como descrito acima, e um grupo quase não treinado ou não especializado de especialistas ou indivíduos pode usar este software. O preço do equipamento de EEG é mais baixo do que um amplificador de EEG normal. O Behavioral Tracking Software também é um dos softwares mais acessíveis para rastreamento de vídeo do mercado. Este software requer licenças anuais. O equipamento pode ser utilizado em mais de um arranjo experimental, diferentes animais e o tipo de versatilidade. Esperamos que este esforço ajude a comunidade científica e proporcione um fácil acesso ao estudo simultâneo do comportamento e da eletroencefalografia.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Sr. Miguel Burgos e ao Sr. Gustavo Lago pela assistência técnica. Somos gratos à Stoelting Co., por cobrir os custos de produção de vídeo, à Jinga-hi, Inc., por fornecer assistência técnica, e à División de Investigación y Posgrado, da Universidad Iberoamericana Ciudad de México, por conceder fundos para este trabalho.
#2 Variable speed rotary tool tip | Reorder #310048, Lenght 44.5mm | SS White | For making the holes where the screws will be inserted |
#4 Scalpel and blade | |||
50 X 50 X 50 cm Open Field Black Mate Arena | |||
8 pin Receptacle Housing Female | Amphenol FCI | 10147606-00008LF | |
8 pin Receptacle Housing Male | Amphenol FCI | 10147603-00008LF | |
Acrylic Resin | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
ANY-maze video tracking software | Stoelting, Co. | version 6.1 | http://www.anymaze.co.uk/) |
benzalkonium chloride antiseptic solution | Benzal | Benzal | |
Bulldog clamps | Cientifica VelaQuin | For retracting the skin | |
Camera | Logitech | c920 | |
Copper wire | |||
Crimp contact | Amphenol FCI | 10147604-01LF | |
DELL PC | DELL | ||
Electrode | |||
JAGA16 | Jinga-Hi, Inc. | JAGA16 | |
Ketamine | PiSA Agropecuaria | ANESKET | For anesthesia |
MATLAB | R2020a | MathWorks | Script was develop ped in collaboration with Jinga-Hi, Inc. |
Monomer | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
Neurophys software | Jinga-Hi, Inc./ Neurosys, LLC | Neurosys 3.0.0.7 | |
Screwdrive | For inserting the screws into the skull | ||
Screws | |||
Screws equiped with electrode | |||
Stereotaxic instrument | KOPF | For the surgery | |
Variable speed rotary tool | Dremel 3000 | Dremel | For making the holes where the screws will be inserted |
Voltmeter | PROAM | MUL-040 | For confirming that the electrode conducts electricity |
Xilazine | PiSA Agropecuaria | PROCIN | For anesthesia |