同时监测无线电生理学和记忆行为测试作为研究海马神经发生的工具

所有程序均遵循国家卫生机构和墨西哥当地法律实施的《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第8023号，1978年修订），以减少用于动物福利的动物数量并禁止动物痛苦。伊比利亚美洲大学伦理委员会批准了在这项研究中使用动物的实验方案。 1. 常规设置 根据制造说明在计算机上安装行为跟踪软件。 将相机直接安装在设备上方，使其朝下。相机应连接到计算机。 安装相机所需的驱动程序软件（按照制造说明进行操作）。 如果相机包含变焦镜头，请调整它们以完全适合相机的显示屏。 按照制造软件关闭相机自动对焦（AF）模式。 确保摄像机实时正常工作，并测试视频捕获模式，直到可以使用为止。 2. 环境富集方案（见图1） 注意：三个月大的雄性Wistar大鼠用于本实验，并在自然暗光条件下保持。 将锯末床上用品放置在透明的亚克力方形竞技场（500 x 500 x 500 mm）中。 在竞技场上放置三种不同类型的玩具，供啮齿动物互动（例如，活动轮、双层甲板、楼梯等）。 添加四个 2 英寸和四个弯曲的灰色不透明 PVC 管。 为食物和饮水机提供 随意接触动物 的机会。 在常规条件下，在动物饲养室内，每个笼子放置三只啮齿动物。 根据相应的协议，将动物留在该竞技场所需的时间。在这个实验中，动物应该在竞技场内停留20天。注意：电极植入手术后，动物不会回到环境富集治疗。相反，它们被放在单个笼子里，直到新的物体识别测试完成。 3. 电极制造工艺 在大约 2 厘米处切割一根铜线，然后用砂纸从两端擦拭约 0.5 厘米。 将铜线的一端滚动到小尺寸螺钉（电极）的头部，并确保其牢固固定，因为这是一个关键步骤。必须保证两种材料之间的正确接触，以避免脑电信号中的伪影。 将另一端插入连接器的端子尖端，并确保使用细镊子加固来正确固定。此尖端应与放大器电缆连接。 使用万用表测量从尖端到螺杆的合适电导率。此过程可确保正确安装电极连接。 4.硬膜外（颅骨螺钉）电极植入手术 注意：经过20天的环境富集治疗后，动物将按照以下描述的程序进行手术： 向动物注射氯胺酮/甲苯噻嗪（90/10毫克/千克，腹腔注射）的混合物。注意：为避免气道阻塞，请等到大鼠停止移动，然后将其从笼子中取出并将动物放在平坦的表面上。注射非甾体抗炎药（美洛昔康 1 mg/kg，皮下）和抗生素（恩诺沙星 2.5 mg/kg，口服）作为先发制人的镇痛药。 一旦大鼠完全麻醉，剃掉大鼠的头部区域。注意：在继续手术之前，请确保动物已完全麻醉。小心地捏住其中一条腿或尾巴。如果动物对刺激有反应，再等几分钟，然后再次捏住它。如果动物对捏没有反应，请转到下一步。如果有所需的设备，强烈建议使用气体麻醉（如异氟醚），因为为了安全起见，它更容易滴定。 首先用耳杆固定双耳，将动物放在立体定位装置上（注意不要伤害动物的内耳）。最后，将门牙放在咬杆上并固定鼻杆。注意：为所有手术为动物提供加热垫，因为此手术中使用的麻醉通常会导致体温过低和呼吸问题。 使用三轮交替的洗必泰或碘基磨砂膏清洁头部区域顶部，然后用生理盐水或酒精冲洗。 在头部区域（0.5 mL）皮肤下皮下注射利多卡因（20 mg/mL）。 每5-10分钟向每只动物的眼睛滴一滴眼药溶液或盐水，以帮助它们不干燥。 使用手术刀，从前向到后方向切开约 2 厘米的切口，以正确暴露颅骨的顶部区域。 使用斗牛犬夹子缩回皮肤并刮擦覆盖在颅骨上的组织。 识别并记录获得的布雷格玛坐标。 从布雷格玛开始，使用立体定位Paxinos和Watson Atlas30，定位并标记电极将固定的七个点（坐标）中的每一个的位置。注意：在这个实验中，F3，F4螺钉（+距布雷格玛2.0毫米，距中线2.25毫米）;C3，C4螺钉（距布雷格玛-3.0毫米，距中线2.75毫米）;和 P3，P4 螺钉（距布雷格玛 −7.0 毫米，距中线 2.75 毫米横向）。第七颗螺钉位于鼻骨（NZ）的后方，作为地面参考（见 图2）。 使用变速钻具，在每个标记上打一个尖端尺寸为 2（长度 44.5 毫米）的孔，注意不要完全穿透头骨。 将电极插入孔中并小心地将其拧入颅骨。 重复步骤 4.10 和 4.11，直到所有七个螺钉都正确固定。 用第一层牙科水泥固定所有 7 个螺钉。将每个电极插入连接器。用第二层牙科水泥（这将防止动物拉下螺丝）和连接器底部完全覆盖电线。如有必要，用第三层牙科水泥覆盖，保持脑电图连接器清洁以进行正确连接，以便可以正确连接脑电图设备（见 图3）。注意：放置每对双边螺钉后，可以用牙科水泥固定这些螺钉（可选步骤）。 将大鼠留在术后护理中过夜。观察动物并在手术后为动物提供加热垫1-2小时，因为该程序中使用的麻醉通常会导致体温过低和呼吸问题。 皮下注射50mL/kg/24h（维持剂量）盐水溶液，以防止脱水。手术后和接下来的24小时内注射非甾体抗炎药（美洛昔康2mg / kg，皮下）和抗生素（恩诺沙星5mg / kg，口服）。 手术后，在进行行为测试之前，将大鼠放在单笼中以在七天内完全恢复。 定期（至少每天一次）轻轻地操纵动物，以帮助减轻未来操作中的压力。在用一只手握住大鼠的同时，手指轻轻地施加在动物的背部，将手指滑过皮毛。手术后一周检查头部伤口、健康状况、一般行为和体重。注意：如果在动物身上发现任何异常或疾病/压力的迹象，请通知负责的兽医。在此期间之后，执行新型物体识别测试和脑电图记录技术。 5. 新型物体识别测试 注意：手术后七天，进行行为测试。在所提出的实验中，所有行为程序都在14小时00分钟和16小时00分钟之间进行，这对应于大鼠的光周期。 将一件由柔软织物制成的背心（在行为测试期间将脑电图装置放置在该背心上）放在大鼠身上。在进行行为测试之前，允许习惯2-3天。 将黑色亚克力方形竞技场（500 x 500 x 500 mm）放置在昏暗照明的录音室中。 使用双面胶带将两个相同的新物体固定在竞技场的地板中心（以防止其被动物移位）。物体之间和竞技场墙壁必须等距。 事先用 50% 乙醇彻底清洁每个物体，并在每次试验后彻底清洁竞技场的地板（以避免嗅觉提示）。注意：始终在每次会议开始前至少半小时将动物转移到宿舍（从动物饲养室到实验室）。完成记录后，将动物留在实验室中再呆一个小时。这是为了避免可能影响此测试性能的压力。 在开始每次测试之前连接脑电图设备。轻轻约束动物，并将电缆牢固地插入动物头部的连接器，并将脑电图套件连接到动物的背部（见 图4）。只允许一个职位。注意：先前对动物的温和操作可能有助于减轻连接过程中动物的压力。否则，设备或动物损坏的风险会增加。使用 USB 端口为设备电池充满电。 新型物体识别测试阶段习惯性：连续两天每隔5分钟处理一次动物，然后立即将动物放在竞技场上（没有任何物体），让它们自由探索10分钟。注意：在执行任何采集和记忆测试会话之前，小心处理大鼠并将其连接到相应的EEG设备，该设备在开始测试之前已正确固定。 获取环节：将动物放在竞技场上，面向与物体相对的一面墙。让动物自由探索10分钟。转到步骤 6.13 以使用行为跟踪软件进行测试记录。注意：确保脑电图装置正确固定附着在大鼠背部的背心（以确保正确跟踪动物）。如需额外加固，请使用遮蔽胶带。 短期记忆测试（SMT）：用形状，颜色和纹理完全不同的任何其他物体替换其中一个物体。在采集过程后2小时，将动物放在面向物体对面的墙壁之一的竞技场中。让动物自由探索10分钟。转到步骤 6.13 以使用行为跟踪软件进行测试记录。 长期记忆测试（LMT）：用与短期记忆测试在形状，颜色和纹理上完全不同的任何其他物体替换所使用的物体。在采集过程后24小时将动物放置在面向物体对面的墙壁之一的竞技场中。让动物自由探索 10 分钟 转到步骤 6.13 使用行为跟踪软件进行测试记录。 6. 行为跟踪软件设置 打开行为跟踪软件。 使用机构的用户和密码登录帐户。 打开点击“新建空实验”，然后选择实验方案的名称（例如，“NORT”）。 选择“视频跟踪模式”。注意：在此实验中，摄像机设置为实时流式传输视频跟踪。但是，还有一个选项可以选择预先录制的视频。 转到“设备”。通过将橙色矩形调整到投影竞技场的极限来定义竞技场区域。确定对象的区域，在屏幕上的摄像机投射的竞技场内对象边界处拟合橙色圆圈。 将比例移动标尺线设置到沿图像（竞技场）已知长度的位置。在“设置”面板上的“标尺线长度为”选项中输入对象的长度（以毫米为单位）。在这种情况下，竞技场的尺寸为 500 x 500 毫米。 转到“跟踪和行为”。继续“区域”。单击“添加项目”菜单，然后选择“新区域”。选择竞技场区域并命名新区域（例如，“场地”）。 对对象的区域重复上一步并命名新区域（例如，“对象”）。 转到“动物颜色”并选择“动物比设备背景浅”选项。注意：白色（Wistar）大鼠用于本实验。但是，该软件为使用黑鼠和斑点大鼠的研究人员提供了其他选择。两种动物都可以在同一实验中使用。 转到“跟踪动物的头部和尾巴”，然后选择“是的，我希望跟踪动物的头部和尾巴”。 转到“测试” |“阶段”，然后从菜单“添加项目”中选择“新建阶段”。将新阶段命名为“收购”。定义阶段的持续时间（例如，600 秒）。 重复“短期记忆测试”和“长期记忆测试”阶段的上一步。注意：在此协议中，所有阶段具有相同的持续时间（10分钟）。 转到“程序”。定义每个阶段（采集、短期记忆测试和长期记忆测试）要跟踪的事件。 开始测试（每只动物）。转到“测试”（在顶部菜单栏中），然后选择“添加测试 （+）”。为要测试的动物分配一个编号（例如，“1”）。 选择“记录”并命名动物和会话（例如，“M1 Acq”）。 在将动物放入竞技场之前，请在“播放”按钮上单击一次。将显示一条消息“等待启动”。 将动物放入竞技场后，再次单击“播放”按钮。测试将自动开始和结束。 对短期记忆测试（采集后2小时）和长期记忆测试（采集后24小时）重复步骤6.13-6.16。 7. 无线电生理设备设置 将调制解调器连接到 PC 主机并将其打开。关闭 PC 上的任何其他网络设备。最好将登记室中的任何其他无线通信静音，例如蓝牙、手机、其他调制解调器甚至无线手机。 将放大器连接到大鼠的背部，如步骤5.5中所述。 通过插入电池打开脑电图设备。注：连接设备2秒后，EEG放大器上的红色LED将闪烁，表示与调制解调器的通信处于活动状态，然后绿色LED将亮起。如果通信成功，调制解调器上的指示灯将开始持续闪烁。放大器现在已准备好向调制解调器发送信息。 启动脑电图软件并根据制造商的说明进行设置，以集成到无线脑电图采集设备中 按“开始显示”按钮。EEG软件将显示实际的信号采集。注意：使用“Windows 任务管理器”分配“实时”优先级模式，以避免在实验过程中丢失信息。 8. 脑电图（EEG）信号记录 在验证脑电图软件正在获取数据后，启动行为跟踪软件，并设置实验方案以验证动物是否在观察区并且设置是否正常工作。 此时，按“开始记录”按钮开始脑电图软件记录。检查采集信号是否正在运行后，在BTS中开始实验。 实验结束后，返回脑电图软件并停止记录过程。记录将使用默认名称保存，该名称由使用以下格式的录制日期组成：“yyyy-mmdd-hhmm_SubjectID_Ephys.plx”。默认情况下，所有记录都保存在脑电图软件（神经物理学数据）文件夹中。 检查是否已创建两个数据文件。记录实验日志或更改名称以避免混淆。 9. 行为任务与脑电信号同步 打开 MATLAB 并执行命令：convert_plx2mat。这样的功能将打开一个浏览器框。转换函数由制造商提供，必须添加到 MATLAB 的路径中。 选择要转换的 *.plx，然后在 MATLAB 的命令行中按“Enter”将其转换为默认参数。 打开 BTS 实验文件并转到“协议”。单击选项“结果，报告和数据”选择两个对象的所有事件，然后单击“选择报告的时间格式”，选择第三个选项：“在HH：MM：SS.SS中将事件时间显示为实时 – 例如13：20：14.791。 现在转到“文件”，然后单击“导出”和“将实验导出为XML”，选中“测试日期和时间”，最后单击“创建XML”。 转到“导出测试数据”，然后单击“保存数据”。将创建一个包含事件时间的.csv文件。 对每个文件重复步骤 9.1 到 9.5。在我们的例子中，三个实验是：ACQ，STM和LTM。 转换 EEG 和行为文件后，将它们收集到单个文件夹中。该文件夹必须有六个文件，分别是三个 .mat 文件和三个.csv。在我们的例子中，文件被称为：PID_01_ACQ_N.mat，PID_02_STM_N.mat，PID_03_LTM_N.mat，PID_01_ACQ_M.csv，PID_02_STM_M.csv和PID_03_LTM_M.csv。 ID是指动物的识别号码。 使用MATLAB打开“procesa_sujeto.m”功能，并将第二行调整为动物的ID。 现在将 MATLAB 移动到这样的文件夹并执行：“procesa_sujeto”以创建与 ACQ、STM 和 LTM 平台上的对象识别相关的 alpha 和 beta 相对带与功率相关的图形。注意：“procesa_sujeto”是执行/运行多个信号处理分析的函数。这些分析总结如下，步骤9.10至9.15。 使用相位校正，用 [5-40] Hz 的 4 阶巴特沃兹带通滤波器过滤每个 EEG 信号。 在进行后续分析之前目视检查信号，并且由于电极放置缺陷或动物运动调整错误而导致的伪影通道被排除在进一步分析之外。 参考公共平均值信号以减轻运动伪影。 分割脑电图信号以形成由BTS派生的时间戳同步的4秒长度的时期。目标事件是对物体的探索，该物体以动物到物体边界的距离为标志。这些事件标记在 BTS 时间戳上，并用作固定窗口位置的标识符。因此，EEG时期由探索开始前的1秒到之后的3秒来界定。在这一点上，没有使用关于探索长度的验证，但将考虑用于未来的研究。 使用韦尔奇周期图方法估计这些时期的光谱功率密度，使用1 s窗口长度，重叠90%，傅里叶变换估计之前的汉宁窗口，使用这些参数实现了1 Hz的分辨率。 通过评估周期图下的面积来评估每个波段的功率谱，给出的值对应于相对能量，这意味着每个脑电波段的能量除以纪元的总能量。此过程还可以减少由于EEG信号伪影而导致的错误估计。