海馬神経新生研究ツールとしての無線電気生理学と記憶行動検査の同時モニタリング

すべての手順は、動物福祉と動物の苦痛の禁止に使用される動物の数を減らすために、国立保健機関およびメキシコの地方法によって実施された実験動物の世話と使用のためのガイド(NIH出版物N°.8023、1978年に改訂)に従います。イベロアメリカーナ大学の倫理委員会は、この研究における動物の使用に関する実験プロトコルを承認しました。 1. 一般設定 製造手順に従って、行動追跡ソフトウェアをコンピューターにインストールします。 カメラを下向きになるように、デバイスの真上に取り付けます。カメラがコンピューターに接続されている必要があります。 カメラに必要なドライバのソフトウェアをインストールします(製造手順に従ってください)。 カメラにズームレンズが含まれている場合は、カメラのディスプレイに完全に収まるように調整します。 製造ソフトウェアに従ってカメラのオートフォーカス(AF)モードをオフにします。 カメラがリアルタイムで正しく機能していることを確認し、使用する準備ができるまでビデオキャプチャモードをテストします。 2.環境エンリッチメントプロトコル(図1を参照) 注:この実験には生後3か月の雄のWistarラットを使用し、自然な暗光条件下で維持しました。 おがくずの寝具を透明なアクリルの正方形のアリーナ(500 x 500 x 500 mm)に置きます。 げっ歯類が相互作用するために、アリーナに3種類のおもちゃを置きます(例:アクティビティホイール、ダブルデッキ、階段など)。 4つの2インチと4つの湾曲した灰色の不透明なPVCチューブを追加します。 食品およびウォーターディスペンサーに動物への 自由 アクセスを提供します。 通常の条件下で、ケージごとに3匹のげっ歯類をビバリウムルームに入れます。 対応するプロトコルに従って必要な時間、動物をこのアリーナに残します。この実験では、動物はアリーナ内に20日間滞在する必要があります。注:電極移植手術後、動物は環境濃縮治療に戻りません。代わりに、新しい物体認識テストが完了するまで、単一のケージに入れられました。 3. 電極製造工程 銅線を約2cmで切り、サンドペーパーを使用して両端から約0.5cmこすります。 銅線の一方の端を小型ネジ(電極)の頭に転がし、これは重要なステップであるため、しっかりと固定されていることを確認します。EEG信号のアーチファクトを回避するために、両方の材料間の正しい接触を保証する必要があります。 もう一方の端をコネクタの端子先端に挿入し、細かい鉗子を使用して補強して適切に固定されていることを確認します。このチップはアンプケーブルで接続する必要があります。 マルチメーターを使用して、先端からネジまでの適切な導電率を測定します。このプロセスにより、電極接続が正しく取り付けられていることが保証されます。 4.硬膜外(頭蓋骨スクリュー)電極移植手術 注:20日間の環境濃縮処理の後、動物は以下に説明する手順に従って手術を受けます。 ケタミン/キシラジン(90/10 mg / kg、i.p.)のカクテルを動物に注射します。.注意: 気道閉塞を避けるために、ラットの動きが止まるまで待ってから、ハウジングケージから取り出して動物を平らな面に置きます。先制鎮痛として、非ステロイド性抗炎症薬(メロキシカム1 mg / kg、s.c.)と抗生物質(エンロフロキサシン2.5 mg / kg、p.o.)を注射します。. ラットが完全に麻酔をかけられたら、ラットの頭の部分を剃ります。注:手術を続ける前に、動物が完全に麻酔をかけられていることを確認してください。片方の足または尾を慎重につまみます。動物が刺激に反応した場合は、さらに数分待ってからもう一度つまんでください。動物がピンチに反応しない場合は、次のステップに進みます。必要な機器が利用可能な場合は、安全性のために滴定が容易なため、ガス麻酔(イソフルランなど)の使用を強くお勧めします。 最初に両耳をイヤーバーで固定して、動物を定位固定装置に置きます(動物の内耳を傷つけないように注意してください)。最後に、前歯をバイトバーの上に置き、ノーズバーを固定します。注:この手順で使用される麻酔は通常、低体温症と呼吸の問題を引き起こすため、すべての手術に動物に加熱パッドを提供します。 クロルヘキシジンまたはヨウ素ベースのスクラブを3回交互に使用して、生理食塩水またはアルコールをすすぎ、ヘッド領域の上部を清掃します。 リドカインを頭の皮膚下(0.5 mL)の皮下に皮下(20 mg / mL)投与します。. 各動物の目に点眼液または生理食塩水を5〜10分ごとに滴下して、乾かないようにします。 メスを使用して、頭蓋骨の上部を適切に露出させるために、前方から後方向に約2 cmの切開を行います。 ブルドッグクランプを使用して皮膚を引っ込め、頭蓋骨の上にある組織をこすります。 取得したブレグマ座標を特定して記録します。 ブレグマから始めて、脳定位固定装置パキシノスとワトソンアトラス30を使用して、電極が固定される7つのポイント(座標)のそれぞれの位置を見つけてマークします。注:この実験では、F3、F4ネジ(ブレグマから+ 2.0 mm、正中線から横方向2.25 mm)です。C3、C4ネジ(ブレグマから-3.0mm、正中線から2.75mmの側面);P3、P4ネジ(ブレグマから-7.0 mm、正中線から2.75 mm)が取り付けられました。7番目のネジは、地面の基準として、鼻骨(NZ)の後方に配置されました( 図2を参照)。 可変速ドリルツールを使用して、各マークに先端サイズ2(長さ44.5 mm)の穴を開け、頭蓋骨を完全に貫通しないように注意してください。 電極を穴に挿入し、頭蓋骨に慎重にねじ込みます。 7 本のネジがすべて適切に固定されるまで、手順 4.10 と 4.11 を繰り返します。 7本のネジすべてを歯科用セメントの最初の層で固定します。各電極をコネクタに挿入します。ワイヤーを歯科用セメントの2番目の層(動物がネジを引っ張るのを防ぎます)とコネクタの底で完全に覆います。必要に応じて、歯科用セメントの3番目の層で覆い、EEGデバイスを適切に接続できるようにEEGコネクタを清潔なままにします( 図3を参照)。注意: 両側ネジの各ペアを配置した後、これらは歯科用セメントで固定できます(オプションの手順)。 ラットを術後ケアに一晩放置します。この手順で使用される麻酔は通常低体温症と呼吸障害を引き起こすため、動物を観察し、手術後1〜2時間動物に加熱パッドを提供します。 脱水を防ぐために、50mL / kg / 24時間(維持用量)の生理食塩水を皮下投与します。.非ステロイド性抗炎症薬(メロキシカム2 mg / kg、s.c.)と抗生物質(エンロフロキサシン5 mg / kg、p.o.)を手術後および次の24時間注射します。. 手術後、行動試験を実施する前に、ラットを7日間完全に回復させるために単一のケージに入れてください。 将来の操作におけるストレスを軽減するために、定期的に(少なくとも1日1回)動物を穏やかに操作します。片手でラットを持ちながら、指の圧力を動物の背中にそっと加え、毛皮を通して指を滑らせます。手術後1週間、頭部の傷、健康状態、行動全般、体重を確認します。注意: 動物に病気/ストレスの異常や兆候が見つかった場合は、担当の獣医に通知してください。この期間の後、新規物体認識テストとEEG記録技術を実行します。 5. 新規物体認識テスト(NORT) 注:手術の7日後に、行動テストに進みます。全ての行動手順は、提示された実験において、ラットの光サイクルに対応する14時間00分と16時間00分の間に行われた。 柔らかい布で作られたベスト(行動テスト中にEEGデバイスが配置される)をラットに置きます。行動テストを実施する前に、2〜3日間慣れさせてください。 黒いアクリルの正方形のアリーナ(500 x 500 x 500 mm)を薄暗い照明の録音室に置きます。 両面テープを使用して、2つの同一の斬新なオブジェクトをアリーナの床の中央に固定します(動物による移動を防ぐため)。オブジェクトは互いに等距離にあり、アリーナの壁から等距離にある必要があります。 事前に50%エタノールで各オブジェクトを完全に洗浄し、各試行後にアリーナの床を洗浄します(嗅覚の手がかりを避けるため)。注:各セッションを開始する少なくとも30分前には、必ず動物を飼育室(ビバリウム室から実験室)に移してください。記録セッションが完了したら、動物をさらに1時間実験室に置いておきます。これは、このテストのパフォーマンスに影響を与える可能性のあるストレスを回避するためです。 各テストを開始する前に、EEGデバイスを接続します。動物をそっと拘束し、動物の背中に取り付けられたEEGキットを使用して、ケーブルを動物の頭のコネクタにしっかりと挿入します( 図4を参照)。許可されるポジションは 1 つだけです。注意: 動物の穏やかな以前の操作は、接続手順中の動物のストレスを軽減するのに役立つ可能性があります。そうしないと、デバイスや動物が損傷するリスクが高まります。USBポートを使用してデバイスのバッテリーを完全にプリ充電します。 新しい物体認識テストフェーズ慣れ:5分間隔で2日間連続して動物を扱い、その直後に動物をアリーナ(物なし)に置き、10分間自由に探索できるようにします。注:獲得および記憶テストセッションを実行する前に、ラットを注意深く取り扱い、対応するEEGデバイスに接続し、テストを開始する前に適切に固定しました。 取得セッション:オブジェクトとは反対側の壁の1つに面したアリーナに動物を置きます。動物が10分間自由に探索できるようにします。手順 6.13 に進み、行動追跡ソフトウェアを使用したテスト記録を行います。注意: EEGデバイスがラットの背中に取り付けられたベストを適切に保持していることを確認してください(動物を適切に追跡するため)。追加の補強には、マスキングテープを使用してください。 短期記憶テスト(SMT):オブジェクトの1つを、形状、色、テクスチャがまったく異なる他のオブジェクトに置き換えます。取得セッションの2時間後に、オブジェクトの反対側の壁の1つに面したアリーナに動物を置きます。動物が10分間自由に探索できるようにします。手順 6.13 に進み、行動追跡ソフトウェアを使用してテスト記録を行います。 長期記憶テスト(LMT):使用したオブジェクトを、短期記憶テストとはまったく異なる形状、色、質感のオブジェクトに置き換えます。取得セッションの24時間後、オブジェクトの反対側の壁の1つに面したアリーナに動物を置きます。動物が10分間自由に探索できるようにします 行動追跡ソフトウェアを使用したテスト記録については、手順6.13に進みます。 6.行動追跡ソフトウェアのセットアップ 行動追跡ソフトウェアを開きます。 インスティテューションのユーザとパスワードを使用してアカウントにログインします。 [新しい空の実験] をタップし、プロトコルの名前 (例: “NORT”) を選択します。 「ビデオトラッキングモード」を選択します。注:この実験では、カメラはビデオトラッキングをライブでストリーミングするように設定されています。ただし、事前に録画されたビデオを選択するための追加のオプションがあります。 「装置」に移動します。オレンジ色の長方形を投影されたアリーナの境界に合わせて調整して、アリーナ領域を定義します。画面上のカメラから投影されたアリーナ内のオブジェクトの境界にオレンジ色の円を合わせ、オブジェクトの領域を決定します。 スケール移動定規線を画像の既知の長さに沿った位置(アリーナ)に設定します。[設定]パネルの[定規線の長さは]オプションにオブジェクトの長さをミリメートル単位で入力します。この場合、アリーナのサイズは500 x 500 mmです。 「トラッキングと行動」に移動します。「ゾーン」に進みます。「アイテムの追加」メニューをクリックし、「新しいゾーン」を選択します。アリーナエリアを選択し、新しいゾーンに名前を付けます(例:「フィールド」)。 オブジェクトの領域で前の手順を繰り返し、新しいゾーンに名前を付けます(例:「オブジェクト」)。 「動物の色」に移動し、「動物は装置の背景よりも明るい」オプションを選択します。注:この実験には白色(ウィスター)ラットを使用しました。ただし、このソフトウェアには、黒ネズミや斑点のあるネズミを使用する研究者向けの追加オプションがあります。両方の種類の動物を同じ実験に使用することができる。 「動物の頭と尾を追跡する」に移動し、「はい、動物の頭と尾を追跡します」を選択します。 「テスト中」へ |「ステージ」をクリックし、メニューから「アイテムを追加」から「新規ステージ」を選択します。新しいステージに「取得」という名前を付けます。ステージの期間を定義します(例:600秒)。 「短期記憶テスト」と「長期記憶テスト」の段階の前のステップを繰り返します。注:このプロトコルでは、すべてのステージの持続時間(10分)が同じです。 「手順」に進みます。各ステージ (獲得、短期記憶テスト、長期記憶テスト) で追跡するイベントを定義します。 (各動物で)テストを開始します。上部のメニューバーの[テスト]に移動し、[テストの追加(+)]を選択します。検査する動物に番号を割り当てます(例:「1」)。 「記録」を選択し、動物とセッションに名前を付けます(例:「M1 Acq」)。 動物をアリーナに配置する前に、「再生」ボタンを1回クリックします。「開始待ち」というメッセージが表示されます。 動物をアリーナに配置した後、「再生」ボタンをもう一度クリックします。テストは自動的に開始および終了します。 短期記憶テスト(取得セッションの2時間後)と長期記憶テスト(取得セッションの24時間後)について、手順6.13〜6.16を繰り返します。 7.ワイヤレス電気生理学デバイスのセットアップ モデムをPCホストに接続し、電源を入れます。PC上の他のネットワークデバイスの電源を切ります。できれば、Bluetooth、携帯電話、他のモデム、さらにはワイヤレスハンドセットなど、登録室での他のワイヤレス通信を無音にします。 ステップ5.5で述べたように、アンプをラットの背中に取り付けます。 バッテリーを接続してEEGデバイスの電源を入れます。注意: デバイスを接続してから2秒後、EEGアンプの赤いLEDが点滅し、モデムとの通信がアクティブであることを示し、緑色のLEDが点灯します。通信が成功すると、モデムのLEDが継続的に点滅し始めます。これで、アンプはモデムに情報を送信する準備が整いました。 EEGソフトウェアを起動し、製造元の指示に従ってセットアップして、ワイヤレスEEG取得デバイスに統合します 「表示開始」ボタンを押します。EEGソフトウェアは、実際の信号取得を表示します。注意: 「Windowsタスクマネージャー」を使用して「リアルタイム」優先モードを割り当て、実験中に情報が欠落しないようにします。 8.脳波(EEG)信号記録 EEGソフトウェアがデータを取得していることを確認した後、行動追跡ソフトウェアを起動し、実験プロトコルを設定して、動物が観察ゾーンにあり、セットアップが正しく機能していることを確認します。 この時点で、「記録開始」ボタンを押してEEGソフトウェア記録を開始します。取得信号が動作していることを確認したら、BTSで実験を開始します。 実験が終了したら、EEGソフトウェアに戻り、記録プロセスを停止します。録音は、次の形式を使用して記録された日付で構成される既定の名前を使用して保存されます: “yyyy-mmdd-hhmm_SubjectID_Ephys.plx”。デフォルトでは、すべての記録はEEGソフトウェア(NeurophysData)フォルダに保存されます。 両方のデータ ファイルが作成されたことを確認します。混乱を避けるために、実験ログを記録するか、名前を変更してください。 9.行動課題と脳波信号の同期 MATLAB を開き、次のコマンドを実行します。 convert_plx2mat.このような関数はブラウザボックスを開きます。変換関数は製造元によって提供されており、MATLAB のパスに追加する必要があります。 変換する* .plxを選択し、MATLABのコマンドラインで「Enter」を押してデフォルトのパラメータに変換します。 BTS実験ファイルを開き、「プロトコル」に移動します。[結果、レポート、およびデータ]オプションをクリックして、両方のオブジェクトのすべてのイベントを選択し、[レポートの時間形式を選択]をクリックして、3番目のオプションを選択します:「イベント時刻をHH:MM:SS.sssでリアルタイムとして表示する-たとえば、13:20:14.791。」 次に、[ファイル]に移動し、[エクスポート]と[実験をXMLとしてエクスポート]をクリックし、[テストの日付と時刻]をオンにして、最後に[XMLの作成]をクリックします。 「テストデータのエクスポート」に移動し、「データの保存」をクリックします。イベント時間を含む.csvファイルが作成されます。 ファイルごとに手順 9.1 から 9.5 を繰り返します。私たちの場合、3つの実験はACQ、STM、およびLTMでした。 EEGファイルとビヘイビアファイルが変換されたら、それらを1つのフォルダーに収集します。フォルダーには、それぞれ 6 つのファイル、3 つの .mat ファイル、および 3 つの.csvが必要です。私たちの場合、ファイルはPID_01_ACQ_N.mat、PID_02_STM_N.mat、PID_03_LTM_N.mat、PID_01_ACQ_M.csv、PID_02_STM_M.csv、PID_03_LTM_M.csvと呼ばれていました。 IDは動物の識別番号を指します。 MATLABを使用して「procesa_sujeto.m」関数を開き、2行目を動物のIDに調整します。 次に、MATLABをそのようなフォルダに移動し、「procesa_sujeto」を実行して、ACQ、STM、およびLTMステージでのオブジェクト認識に関連するアルファおよびベータ相対バンド対パワーの図を作成します。注:「procesa_sujeto」は、いくつかの信号処理解析を実行/実行する関数です。これらの分析は、ステップ9.10から9.15に次のように要約されます。 位相補正を使用して、[5-40] Hzの4次バターワースバンドパスフィルターで各EEG信号をフィルタリングします。 以下の分析の前に信号を目視検査し、動物の動きによる欠陥電極の配置または調整ミスに由来するアーチファクトを有するチャネルは、さらなる分析から除外された。 信号を共通平均に参照して、モーションアーチファクトを軽減します。 脳波信号をセグメント化して、BTSから派生したタイムスタンプによって同期された4秒の長さのエポックを形成します。対象となるイベントは、動物と物体の境界までの距離によってマークされた物体の探査でした。これらのイベントはBTSタイムスタンプでマークされ、識別子がウィンドウの位置を修正するために使用されました。したがって、EEGエポックは、探査が始まる1秒前から3秒後までで区切られます。現時点では、探査長に関する検証は行われていませんが、今後の研究で検討されます。 これらのパラメータを使用して、1秒のウィンドウ長、90%のオーバーラップ、フーリエ変換推定前のハニングウィンドウを使用してウェルチのピリオドグラム法を使用して、これらのエポックのスペクトルパワー密度を推定し、1Hzの分解能を達成しました。 ピリオドグラム下の領域を評価することによって各バンドのパワースペクトルを評価し、提示された値は相対エネルギーに対応し、各EEGバンドのエネルギーをエポックの総エネルギーで割ったことを意味します。この手順はまた、EEG信号のアーチファクトによる誤った推定を減らします。