Detección de Phytophthora capsici en agua de riego mediante amplificación isotérmica mediada por bucle

El reciclaje de agua en granjas y viveros se está volviendo cada vez más popular debido al aumento de los costos de agua y las preocupaciones ambientales detrás del uso del agua. Se han desarrollado muchos métodos de riego para los cultivadores para reducir la propagación y la aparición de enfermedades de las plantas. Independientemente de la fuente del agua (irrigación o precipitación), se genera escorrentía, y muchos cultivadores de hortalizas y viveros tienen un estanque para recoger y reciclar la escorrentía¹. Esto crea un reservorio para una posible acumulación de patógenos favoreciendo la propagación de patógenos cuando el agua reciclada se utiliza para regar cultivos^2,3,4. Los patógenos de las plantas de oomycete se benefician particularmente de esta práctica, ya que las zoosporas se acumularán en el agua y la espora dispersiva primaria es automotilo pero requiere agua superficial^5,,6,,7. Phytophthora capsici es un patógeno oomiceto que afecta a un número significativo de cultivos solanáceos y cucuridos de diferentes maneras⁸. A menudo, los síntomas son amortiguación de las plántulas, la pudrición de la raíz y la corona; sin embargo, en cultivos como el pepino, la calabaza, el melón, la calabaza, la sandía, la berenjena y la pimienta, las cosechas enteras pueden perderse debido a la putrefacción de la fruta⁹. Aunque existen métodos conocidos para detectar este patógeno vegetal, la mayoría requieren que ya se haya producido una infección que es demasiado tarde para que los fungicidas preventivos tengan un efecto significativo^10.

El método tradicional para probar el agua de riego para la detección y diagnóstico de microorganismos específicos es un enfoque anticuado cuando la velocidad y la sensibilidad son cruciales para el éxito y la producción rentable de cultivos^11,,12. El tejido vegetal susceptible al patógeno objetivo (por ejemplo, la berenjena para P. capsici)se une a una trampa modificada que se suspende en un estanque de riego durante un período prolongado antes de ser retirada e inspeccionada en busca de infección. Las muestras del tejido vegetal se chapan en medios semies selectivos (PARPH) y se incuban para el crecimiento del cultivo, luego la identificación morfológica se realiza utilizando un microscopio compuesto¹³. Existen otros métodos de detección similares para otros patógenos vegetales que utilizan medios selectivos y enchapar pequeñas cantidades de agua contaminada antes del sub-cultivo^14,15. Estos métodos requieren entre 2 y 6 semanas, varias rondas de sub-cultivo para aislar el organismo, y experiencia en diagnóstico Phytophthora para ser capaz de reconocer los caracteres morfológicos clave de cada especie. Estos métodos tradicionales no funcionan bien para la detección de agua de riego contaminada por P. capsici debido a factores como la interferencia de otros microorganismos que también están presentes en las fuentes de agua. Algunos microorganismos de rápido crecimiento como Pythium spp. y las bacterias transmitidas por el agua pueden crecer en exceso en la placa haciendo que P. capsici no sea detectable^16,17.

El propósito de este estudio fue desarrollar un método molecular sensible y específico que se pueda utilizar tanto en entornos de campo como de laboratorio para detectar las zoosporas P. capsici en el agua de riego. El protocolo incluye el desarrollo de un novedoso conjunto de imprimación de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) capaz de amplificar específicamente P. capsici,basado en un fragmento de par de 1121 bases (bp) de P. capsici^18,,19. (2015) se utilizó una imprimación LAMP previamente desarrollada de Dong et al. (2015) en comparación con el ensayo que se desarrolló para este estudio²⁰.

El ensayo LAMP es una forma relativamente nueva de detección molecular que se ha demostrado que es más rápida, sensible y específica que la reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR)²¹. En general, los ensayos de PCR convencionales no pueden detectar menos de 500 copias (1,25 pg/L); por el contrario, estudios anteriores han demostrado que la sensibilidad de LAMP puede ser de 10 a 1.000 veces mayor que la PCR convencional y puede detectar fácilmente incluso 1 fg/L de ADN genómico^22,,23. Además, el ensayo se puede llevar a cabo rápidamente (a menudo en 30 minutos) y in situ (en el campo) mediante el uso de un bloque de calentamiento portátil para la amplificación y un tinte colorimétrico que cambia de color para una muestra positiva (eliminando la necesidad de electroforesis). En este estudio, comparamos la sensibilidad de los ensayos de PCR y LAMP utilizando un método de extracción de filtros. El método de detección propuesto permite a los investigadores y agentes de extensión detectar fácilmente la presencia de esporas de P. capsici de diferentes fuentes de agua en menos de dos horas. El ensayo ha demostrado ser más sensible que el PCR convencional y se validó in situ mediante la detección de la presencia del patógeno en el agua de riego utilizada por un cultivador. Este método de detección permitirá a los cultivadores estimar la presencia y densidad de población del patógeno en diversas fuentes de agua que se utilizan para el riego, evitando brotes devastadores y pérdidas económicas.