Conjugados BODIPY convencionais para microscopia de super-resolução de células vivas e rastreamento de moléculas únicas
Summary
Conjugados BODIPY convencionais podem ser usados para microscopia de localização de moléculas únicas de células vivas (SMLM) através da exploração de seus dimers de estado terrestre transitoriamente formados. Apresentamos um protocolo SMLM otimizado para rastrear e resolver lipídios neutros subcelulares e ácidos graxos em células de mamíferos vivos e leveduras na escala de comprimento nanoscópico.
Abstract
As técnicas de microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM) superam o limite de difração óptica da microscopia convencional de fluorescência e podem resolver estruturas intracelulares e a dinâmica das biomoléculas com precisão de ~20 nm. Um pré-requisito para SMLM são fluoroforos que transitam de um estado escuro para um fluorescente, a fim de evitar a sobreposição espátula-temporal de suas funções de spread de ponto em cada um dos milhares de quadros de aquisição de dados. BodipYs são corantes bem estabelecidos com numerosos conjugados usados na microscopia convencional. A formação transitória de dimers de estado terrestre BODIPY de mudança vermelha (DII) resulta em emissão de molécula única brilhante permitindo microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM). Aqui apresentamos um protocolo simples, mas versátil para SMLM com conjugados BODIPY convencionais em leveduras vivas e células de mamíferos. Este procedimento pode ser usado para adquirir imagens de super-resolução e para rastrear estados bodipy-DII únicos para extrair informações espáteris-temporais de conjugados BODIPY. Aplicamos este procedimento para resolver gotículas lipídicas (LDs), ácidos graxos e lisosomos em leveduras vivas e células mamíferas na escala de comprimento nanoscópico. Além disso, demonstramos a capacidade de imagem multicolorido com corantes BODIPY quando usados em conjunto com outras sondas fluorescentes. Nossos resultados representativos mostram a distribuição espacial diferencial e a mobilidade dos ácidos graxos BODIPY e lipídios neutros na levedura sob condições alimentadas e jejuadas. Este protocolo otimizado para SMLM pode ser usado com centenas de conjugados BODIPY disponíveis comercialmente e é um recurso útil para estudar processos biológicos na nanoescala muito além das aplicações deste trabalho.
Introduction
Técnicas de microscopia de localização de molécula única (SMLM), como microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e microscopia de localização ativada por foto (PALM) surgiram como métodos para gerar imagens de super-resolução com informações além do limite de difração óptica da Abbe1,,2 e para o rastreamento da dinâmica de biomoléculas únicas3,,4. Um dos requisitos para sondas compatíveis com SMLM é a capacidade de controlar o número de fluoroforos ativos a qualquer momento para evitar a sobreposição espacial de suas funções de propagação de ponto (PSF). Em cada um dos milhares de quadros de aquisição de dados, a localização de cada fluoroforos fluorescentes é então determinada com precisão de ~20 nm, encaixando sua função de propagação de ponto correspondente. Tradicionalmente, o piscar on-off de fluoroforos tem sido controlado através de fotostocásticas1,,2,5 ou quimicamente induzido piscando6. Outras abordagens incluem a ativação induzida de fluorogens sobre a ligação transitória a uma proteína ativante de fluorogen7,8 e a vinculação programável de oligômeros de DNA rotulados em fluorescência de reflexão interna total (TIRF) ou excitação de folha de luz9. Recentemente, relatamos uma nova e versátil estratégia de rotulagem para o SMLM10, na qual os estados diméricos de mudança vermelha (DII)anteriormente relatados de boro di-pirometano convencional (BODIPY) conjugados11,,12,13 estão se formando transitoriamente e tornam-se especificamente animados e detectados com comprimentos de onda de mudança vermelha.
BODIPYs são corantes amplamente utilizados com centenas de variantes que rotulam especificamente compartimentos subcelulares e biomoléculas14,,15,,16. Devido à sua facilidade de uso e aplicabilidade em células vivas, as variantes BODIPY estão comercialmente disponíveis para microscopia de fluorescência convencional. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado e otimizado sobre como as centenas de conjugados BODIPY disponíveis comercialmente podem ser usados para SMLM de células vivas. Ao ajustar a concentração de monômeros BODIPY e otimizando os poderes de laser de excitação, os parâmetros de análise de imagens e dados, imagens de super-resolução de alta qualidade e dados de rastreamento de moléculas únicas são obtidos em células vivas. Quando utilizados em baixa concentração (25-100 nM), os conjugados BODIPY podem ser usados simultaneamente para SMLM no canal de mudança vermelha e para microscopia de fluorescência convencional correlativa no canal de emissão convencional. Os dados de molécula única obtidos podem ser analisados para quantificar a organização espacial de estruturas imóveis e extrair os estados difusivos de moléculas em células vivas17. A disponibilidade de sondas BODIPY em formas verde e vermelha permite imagens multicoloridos quando usadas na combinação certa com outros fluoroforos compatíveis.
Neste relatório, fornecemos um protocolo otimizado para aquisição e análise de dados SMLM de células vivas usando BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 vermelho e verde-lysotracker em múltiplas cores. Resolvemos ácidos graxos e lipídios neutros em leveduras vivas e células mamíferas com resolução de ~30 nm. Demonstramos ainda que as células de levedura regulam a distribuição espacial de ácidos graxos adicionados externamente, dependendo de seu estado metabólico. Descobrimos que os ácidos graxos BODIPY (FA) adicionados localizam-se ao ânticulo endoplasmático (ER) e gotículas lipídicas (LDs) sob condições alimentadas, enquanto bodipy-FAs formam aglomerados não-LD na membrana plasmática após o jejum. Estendemos ainda mais a aplicação dessa técnica a líssomos de imagem e LDs em células de mamíferos vivos. Nosso protocolo otimizado para SMLM usando conjugados BODIPY convencionais pode ser um recurso útil para estudar processos biológicos na nanoescala com a miríade de conjugados BODIPY disponíveis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, demonstramos como conjugados BODIPY convencionais podem ser usados para obter imagens SMLM com uma ordem de melhoria de magnitude na resolução espacial. Este método baseia-se na exploração de estados DII previamente relatados de corantes BODIPY convencionais, que se formam transitoriamente através de encontros bi-moleculares. Esses estados podem ser especificamente animados e detectados com comprimentos de onda com mudanças vermelhas e são esparsos e de curta duração suficiente para …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio número R21GM127965.
Materials
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror | |
Referências
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