Conjugaciones BODIPY convencionales para microscopía de superresolución de células vivas y seguimiento de una sola molécula
Summary
Los conjugados BODIPY convencionales se pueden utilizar para la microscopía de localización de células vivas de una sola molécula (SMLM) a través de la explotación de sus dimers de estado de tierra de formación transitoria y cambio de rojo. Presentamos un protocolo SMLM optimizado para rastrear y resolver lípidos neutros subcelulares y ácidos grasos en mamíferos vivos y células de levadura a escala de longitud nanoscópica.
Abstract
Las técnicas de microscopía de localización de molécula única (SMLM) superan el límite de difracción óptica de la microscopía de fluorescencia convencional y pueden resolver las estructuras intracelulares y la dinámica de las biomoléculas con una precisión de 20 nm. Un requisito previo para SMLM son los fluoróforos que pasan de un estado oscuro a un estado fluorescente para evitar la superposición espacio-temporal de sus funciones de propagación de puntos en cada uno de los miles de marcos de adquisición de datos. Los BODIPYs son tintes bien establecidos con numerosos conjugados utilizados en la microscopía convencional. La formación transitoria de dimers de estado de tierra BODIPY (DII)de cambio rojo da como resultado una emisión brillante de molécula única que permite la microscopía de localización de molécula única (SMLM). Aquí presentamos un protocolo simple pero versátil para SMLM con conjugados BODIPY convencionales en levaduras vivas y células de mamíferos. Este procedimiento se puede utilizar para adquirir imágenes de superresoría y para rastrear estados únicos BODIPY-DII para extraer información espacio-temporal de conjugados BODIPY. Aplicamos este procedimiento para resolver las gotas lipídicas (LD), los ácidos grasos y los lisosomas en las células vivas de levadura y mamíferos en la escala de longitud nanoscópica. Además, demostramos la capacidad de imagen multicolor con tintes BODIPY cuando se utilizan junto con otras sondas fluorescentes. Nuestros resultados representativos muestran la distribución espacial diferencial y la movilidad de los ácidos grasos BODIPY y los lípidos neutros en levaduras en condiciones de alimentación y ayuno. Este protocolo optimizado para SMLM se puede utilizar con cientos de conjugados BODIPY disponibles comercialmente y es un recurso útil para estudiar procesos biológicos a nanoescala mucho más allá de las aplicaciones de este trabajo.
Introduction
Las técnicas de microscopía de localización de una sola molécula (SMLM) como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la microscopía de localización fotoactivada (PALM) han surgido como métodos para generar imágenes de superresolución con información más allá del límite de difracción óptica de Abbe1,,2 y para el seguimiento de la dinámica de biomoléculas individuales3,,4. Uno de los requisitos para las sondas compatibles con SMLM es la capacidad de controlar el número de fluoróforos activos en cualquier momento para evitar la superposición espacial de sus funciones de propagación de puntos (PSF). En cada uno de los miles de marcos de adquisición de datos, la ubicación de cada fluoróforos fluorescentes se determina con una precisión de 20 nm ajustando su función de dispersión de puntos correspondiente. Tradicionalmente, el parpadeo de encendido y apagado de los fluoróforos se ha controlado a través de fotointerrupción estocástica1,2,5 o intermitente intrínseco inducido químicamente6. Otros enfoques incluyen la activación inducida de fluorógenos en la unión transitoria a una proteína activadora de fluorógeno7,8 y la unión programable-unión-desvinculación de oligómeros de ADN etiquetados en fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) o excitación de lámina de luz9. Recientemente, informamos de una novedosa y versátil estrategia de etiquetado para SMLM10 en la que previamente se informaba de dimeric de cambio en rojo (DII)estados de conjugados convencionales de boro di-pirametano (BODIPY)11,12,13 se forman transitoriamente y se excitan específicamente y se detectan con longitudes de onda cambiadas en rojo.
Los BODIPYs son tintes ampliamente utilizados con cientos de variantes que etiquetan específicamente compartimentos subcelulares y biomoléculas14,,15,,16. Debido a su facilidad de uso y aplicabilidad en células vivas, las variantes BODIPY están disponibles comercialmente para la microscopía de fluorescencia convencional. Aquí, describimos un protocolo detallado y optimizado sobre cómo los cientos de conjugados BODIPY disponibles comercialmente se pueden utilizar para SMLM de células vivas. Al ajustar la concentración de monómeros BODIPY y al optimizar los poderes del láser de excitación, los parámetros de diagnóstico por imágenes y datos, se obtienen imágenes de alta calidad de superresolución y datos de seguimiento de moléculas únicas en células vivas. Cuando se utilizan a baja concentración (25-100 nM), los conjugados BODIPY se pueden utilizar simultáneamente para SMLM en el canal de cambio rojo y para la microscopía de fluorescencia convencional correlativa en el canal de emisión convencional. Los datos obtenidos de una sola molécula se pueden analizar para cuantificar la organización espacial de las estructuras inmóviles y extraer los estados difusos de las moléculas en las células vivas17. La disponibilidad de sondas BODIPY en formas verdes y rojas permite obtener imágenes multicolor cuando se utilizan en la combinación correcta con otros fluoróforos compatibles.
En este informe, proporcionamos un protocolo optimizado para adquirir y analizar datos SMLM de células vivas utilizando BODIPY-C12,BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rojo y lysotracker-green en múltiples colores. Resolvemos ácidos grasos y lípidos neutros en levaduras vivas y células de mamíferos con una resolución de 30 nm. Además, demostramos que las células de levadura regulan la distribución espacial de los ácidos grasos añadidos externamente dependiendo de su estado metabólico. Encontramos que los ácidos grasos BODIPY añadidos (FA) se localizan en el retículo endoplasmático (ER) y las gotas de lípidos (LD) en condiciones de alimentación, mientras que BODIPY-FAs forman racimos no LD en la membrana plasmática al en ayunar. Ampliamos aún más la aplicación de esta técnica para tomar imágenes de lisosomas y LDs en células de mamíferos vivos. Nuestro protocolo optimizado para SMLM utilizando conjugados BODIPY convencionales puede ser un recurso útil para estudiar los procesos biológicos a nanoescala con los innumerables conjugados BODIPY disponibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, demostramos cómo los conjugados BODIPY convencionales se pueden utilizar para obtener imágenes SMLM con una mejora del orden de magnitud en la resolución espacial. Este método se basa en la explotación de los estados DII previamente reportados y desplazados en rojo de los tintes BODIPY convencionales, que se forman transitoriamente a través de encuentros bimolemosos. Estos estados pueden ser específicamente excitados y detectados con longitudes de onda cambiadas en rojo y son lo sufic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio R21GM127965.
Materials
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror | |
Referências
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