Convenzionale BODIPY Coniugato per la microscopia a super-risoluzione a celle vive e il tracciamento a singola molecola
Summary
I coniugati BODIPY convenzionali possono essere utilizzati per la microscopia per la localizzazione a singola molecola a cellule vive (SMLM) attraverso lo sfruttamento dei loro dimeri di stato del suolo con formazione transitoria e spostata verso il rosso. Vi presentiamo un protocollo SMLM ottimizzato per tracciare e risolvere i lipidi neutri subcellulari e gli acidi grassi nelle cellule viventi di mammiferi e lieviti alla scala nanoscopica della lunghezza.
Abstract
Le tecniche di microscopia per localizzazione a singola molecola (SMLM) superano il limite di diffrazione ottica della microscopia a fluorescenza convenzionale e possono risolvere le strutture intracellulari e la dinamica delle biomolecole con precisione di 20 nm. Un prerequisito per SMLM sono i fluorofori che passano da uno stato scuro a uno stato fluorescente per evitare la sovrapposizione spatio-temporale delle loro funzioni di diffusione dei punti in ciascuna delle migliaia di fotogrammi di acquisizione dei dati. I BODIPY sono coloranti consolidati con numerosi coniugati utilizzati nella microscopia convenzionale. La formazione transitoria di dimeri a stato del suolo BODIPY (DII)con spostamento rosso determina l’emissione luminosa di una singola molecola che consente la microscopia per la localizzazione a singola molecola (SMLM). Qui presentiamo un protocollo semplice ma versatile per SMLM con tradizionali coniugati BODIPY in cellule di lievito vivo e mammiferi. Questa procedura può essere utilizzata per acquisire immagini a super-risoluzione e per tenere traccia di singoli stati BODIPY-DII per estrarre informazioni spatio-temporali di BODIPY. Applichiamo questa procedura per risolvere le goccioline di lipidi (LD), gli acidi grassi e i lisosomi nelle cellule di lievito e mammiferi viventi su scala nanoscopica. Inoltre, dimostriamo la capacità di imaging multicolore con coloranti BODIPY se usato in combinazione con altre sonde fluorescenti. I nostri risultati rappresentativi mostrano la distribuzione spaziale differenziale e la mobilità degli acidi grassi BODIPY e dei lipidi neutri nel lievito in condizioni di alimentazione e digiuno. Questo protocollo ottimizzato per SMLM può essere utilizzato con centinaia di coniugati BODIPY disponibili in commercio ed è una risorsa utile per studiare i processi biologici su scala nanometrica ben oltre le applicazioni di questo lavoro.
Introduction
Le tecniche di microscopia di microscopia di localizzazione a singola molecola (SMLM) come la microscopia stocastica della ricostruzione ottica (STORM) e la microscopia di localizzazione foto-attivata (PALM) sono emerse come metodi per generare immagini super-risoluzione con informazioni oltre il limite di diffrazione ottica di Abbe1,2 e per monitorare la dinamica delle singole biomolecole3,4. Uno dei requisiti per le sonde compatibili con SMLM è la capacità di controllare il numero di fluorofori attivi in qualsiasi momento per evitare la sovrapposizione spaziale delle loro funzioni di diffusione punti (PSF). In ognuna delle migliaia di frame di acquisizione dati, la posizione di ogni fluoroforo fluorescente fluorescente viene quindi determinata con una precisione di 20 nm adattando la funzione di diffusione dei punti corrispondente. Tradizionalmente, l’oscillazione dei fluorofori è stata controllata attraverso il fotoscambio stocastico1,2,5 o intrinseco indotto chimicamente6. Altri approcci includono l’attivazione indotta di fluorogeni al momento del legame transitorio con una proteina attivante fluorogena7,8 e l’annullamento programmabile di oligomeri di DNA etichettati nella fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) o nell’espirazione del foglio chiaro9. Recentemente, abbiamo segnalato una nuova e versatile strategia di etichettatura per SMLM10 in cui in precedenza segnalato stati dimeric dimeerici spostati in rosso (DII)di di-pyromethane di boro convenzionale (BODIPY) coniugati11,12,13 sono transitoriamente formando e diventare specificamente eccitato e rilevato con lunghezze d’onda rosso-spostato.
I BODIPY sono coloranti ampiamente utilizzati con centinaia di varianti che etichettano specificamente compartimenti subcellulari e biomolecole14,15,16. Grazie alla loro facilità d’uso e all’applicabilità nelle cellule viventi, le varianti BODIPY sono disponibili in commercio per la microscopia a fluorescenza convenzionale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato e ottimizzato su come le centinaia di coniugati BODIPY disponibili in commercio possono essere utilizzati per SMLM a cellule vive. Ottimizzando la concentrazione dei monomeri BODIPY e ottimizzando i poteri laser di eccitazione, i parametri di imaging e analisi dei dati, le immagini di alta qualità della super-risoluzione e i dati di tracciamento delle singole molecole si ottengono nelle cellule viventi. Se utilizzato a bassa concentrazione (25-100 nM), i coniugati BODIPY possono essere utilizzati simultaneamente per SMLM nel canale rosso e per la microscopia a fluorescenza convenzionale correlata nel canale di emissione convenzionale. I dati ottenuti a singola molecola possono essere analizzati per quantificare l’organizzazione spaziale delle strutture immobili e per estrarre gli stati diffusivi delle molecole nelle cellule viventi17. La disponibilità di sonde BODIPY sia in forma verde che rossa consente l’imaging multicolore se utilizzato nella giusta combinazione con altri fluorofori compatibili.
In questo rapporto, forniamo un protocollo ottimizzato per l’acquisizione e l’analisi dei dati SMLM delle cellule vive utilizzando BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rosso e lysotracker-verde in più colori. Risolviamo gli acidi grassi e i lipidi neutri in lieviti vivi e cellule di mammiferi con risoluzione di 30 nm. Dimostriamo inoltre che le cellule di lievito regolano la distribuzione spaziale degli acidi grassi aggiunti esternamente a seconda del loro stato metabolico. Troviamo che gli acidi grassi BODIPY aggiunti (FA) si localizzano al reticolo endoplasmico (ER) e alle goccioline di lipidi (LD) in condizioni di alimentazione, mentre i cluster BODIPY-FAs formano cluster non-LD nella membrana plasmatica al digiuno. Estendiamo ulteriormente l’applicazione di questa tecnica per immaginare lisosomi e LD nelle cellule di mammiferi viventi. Il nostro protocollo ottimizzato per SMLM che utilizza coniugati BODIPY convenzionali può essere una risorsa utile per studiare i processi biologici su scala nanometrica con la miriade di coniugati BODIPY disponibili.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, abbiamo dimostrato come i coniugati BODIPY convenzionali possono essere utilizzati per ottenere immagini SMLM con un miglioramento dell’ordine di grandezza nella risoluzione spaziale. Questo metodo si basa sullo sfruttamento degli stati DII segnalati in precedenza di colori ROSSI di coloranti BODIPY convenzionali, che si formano transitoriamente attraverso incontri bimolecolari. Questi stati possono essere specificamente eccitati e rilevati con lunghezze d’onda spostate verso il rosso e s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health con il numero di premio R21GM127965.
Materials
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror | |
Referências
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
- Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), 4077 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
- Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
- Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
- Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2′-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
- Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
- Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
- Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
- Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
- Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).
