Här presenterar vi ett protokoll som används för att utföra traction force mikroskopi experiment på B-celler. Vi beskriver beredningen av mjuka polyakrylamid geler och deras funktionalisering, samt data förvärv i mikroskopet och en sammanfattning av data analys.
Traction force microscopy (TFM) möjliggör mätning av krafter som produceras av en cell på ett substrat. Denna teknik härda slutsatsen dragkraft mätningar från ett experimentellt observerade förskjutning fält som produceras av en cell drar på ett elastiskt substrat. Här anpassade vi TFM för att undersöka den rumsliga och tidsmässiga strukturen hos kraftfältet som utövas av B-celler när de aktiveras av antigen engagemang av B-cellens receptorn. Gelstelitet, pärldensitet och proteinfunktionalisering måste optimeras för studier av relativt små celler (~ 6 μm) som interagerar med, och svarar specifikt på ligander för cellytreceptorer.
B-celler är de antikroppsproducerande cellerna i immunsystemet. För att aktivera det adaptiva immunsvaret förvärvar de först antigenet i en infödd form (dvs icke-bearbetad) genom en specifik receptor som kallas B-cellreceptor (BCR)1. Denna process sker i lymfkörtknuten B cellzonen. Även om vissa antigener kan nå B-cellen genom lymfvätskor, de flesta antigener, särskilt med hög molekylvikt (>70 kDa, som är gränsen storlek för lymfatiska ledningar) verkligen presenteras i sin inhemska form på ytan av en antigen presentera cell (APC), typiskt en subcapsular sinus makrofag eller follikulär dendritisk cell, genom lectin eller Fc receptorer (icke-specifika). Kontakten med denna cell leder till bildandet av en immunsynaps där BCR utövar kraft på de APC-associerade antigenerna. Bindningen av ett antigen till BCR initierar BCR-signalering, som kan aktivera kraftalstrande mekanismer. Dessa krafter kan vara viktiga för att förstärka BCR-signalering, men är också nödvändiga för B-celler att extrahera och sedan internalisera antigenet.
Nyligen genomförda studier har visat att BCR verkligen är mekanosenstiv2. Till exempel styvare substrat framkallar förstärkt BCR signalering3. Dessutom, kraft som genereras vid immun synapsen drar på enda BCRs att sond dess affinitet till antigen och därigenom säkerställa affinitet diskriminering4. Det är därför intressant att undersöka den mekaniska responsen av B-celler till antigen presentation och att dissekera detta svar i termer av typ av inblandade receptorer (IgG/ IgM)5, adhesion molekyler (integrin ligander) eller i farmakologiskt och genetiskt modifierade celler (dvs. tysta ett protein nedströms BCR signalering eller cytolesketon dynamik)6.
En enkel metod för att observera en cells respons på ett substrat av fysiologisk stelhet och samtidigt studiekrafter som utövas på substratet är Traction Force Microscopy (TFM). TFM består av att observera det förskjutningsfält som produceras av cellen dra på ett elastiskt substrat. Ursprungligen deformation av gelen observerades genom rynkor av elastomeren själv genom fas-kontrast mikroskopi7, men införandet av fluorescens microbeads som fiducial markörer tillåtet för bättre upplösning och har sedan dess blivit standard8. Denna metod har använts för att undersöka den dragkraft som utövas av anhängare celler, vävnader, och även organoider inbäddade i geler. Flera varianter av TFM har utvecklats9 inklusive, kombination med superresolution mikroskopi (dvs, STED10 eller SRRF11), modifiering av brytningsindex för gelen för att möjliggöra TIRF mikroskopi12, ersätter pärlor med nano-tryckta mönster13, och med hjälp av nanopillars i stället för plan yta14. För en fullständig genomgång av dessa variationer, se Colin-York et al.15.
Protokollet presenteras här beskriver ett förfarande för att mäta krafter som utövas av B-celler på en antigen-belagda substrat. Dessa krafter appliceras på liganderna (antigen) för att klustra dem och därefter utvinna dem ur det antigenpresentativa substratet. Vi har anpassat standard-TFM-protokollet för att efterlikna styvheten hos fysiologiska antigenpresentande substrat, storleken och den relevanta beläggningen för B-cellerna. Detta protokoll möjliggör studier av flera celler samtidigt och kan användas tillsammans med fluorescensmikroskopi tekniker och kemiska behandlingar. Det syftar dock inte till att sond enda molekyl kraft mätningar, för vilka optisk pincett16, molekylär spänning sonder17,18, biomembran kraft sonder19, och atomkraft mikroskopi20 är mer lämpliga tekniker. Jämfört med andra encelliga kraftmätningsmetoder (t.ex., mikropipettes21 eller mikroplattor22) tillåter TFM för rekonstruktion av en komplett karta över de krafter som utövas vid synapsen med en upplösning på ~300 nm. Detta är användbart för att identifiera spatio-temporala mönster i de krafter som utövas på ytan och, som gelen är kompatibel med confocal avbildning, att korrelera dem med rekrytering av specifika proteiner (till exempel cytoskelett och signalering proteiner).
Även om 3D TFM är möjligt, är det inte förenligt med styvhet och setup vi använde. Deformationer i 3D kan uppnås genom andra mer komplexa uppställningar såsom utsprång kraft mikroskopi (AFM skanning en deformerbar membran där cellerna är pläterade)23,24 ochelastisk resonator störningar stress mikroskopi (ERISM, en gel som fungerar som resonans hålighet för ljus och belysa deformationer av substratet med noggrannhet på några nanometer)25. Även om dessa tekniker är mycket lovande, har de ännu inte varit anställda i B-celler. Andra typer av TFM, såsom på nanopillars14, skulle kunna användas för att ha mer reproducerbara substrat. Denna geometri är dock inte anpassad till mjuka celler då cellen interpenetrates pelarna, vilket komplicerar analysen. Detta tillvägagångssätt har verkligen använts i T-celler för att observera cellens förmåga att bygga strukturer runt pelarna26.
Trots sin enkelhet, TFM med hjälp av polyakrylamid geler möjliggör samtidig observation av många celler och kan enkelt och billigt genomföras i alla lab utrustad med en bänk och en epifluorescens mikroskop (även om vi rekommenderar confocal/spinning disk).
För att efterlikna den fysiologiska styvheten hos en APC använde vi polyakrylamidgeler med en styvhet på ~500 Pa27 och funktionaliserade gelen med aktiverande antigener. I detta protokoll, vi funktionaliserade ytan av polyacrylamide gel med hen ägg lysozym (HEL). Detta möjliggör mätning av krafter som genereras genom stimulering av BCR genom engagemang av antigenbindningsstället. Användningen av detta antigen och de HEL-specifika B-cellerna från MD4-möss säkerställer relativt enhetlig kraftgenerering som svar på antigenligering28. Andra molekyler (såsom anti-IgM för B6-möss) kan dock ympas på gelen, men de krafter som genereras i dessa fall kan vara mer heterogena och mindre intensiva. Eftersom B-celler är små celler (diameter ~6 μm) har antalet pärlor optimerats för att vara maximalt men ändå spårbart. För stora celler som utövar ~kPa-krafter på sina substrat kan man uppnå tillfredsställande resultat med hjälp av relativt glesa pärlor eller utföra enkla partikelbildshastigheter (PIV) för att rekonstruera deformationsfältet. Men för små celler som B-lymfocyter som utövar stress så liten som ~ 50 Pa, är användningen av en partikel spårning krävs (partikel spårning velocimetry, PTV) för att uppnå önskad noggrannhet vid rekonstruera deformation fältet. För att på ett tillförlitligt sätt spåra pärlor individuellt, förstoringen av objektivet linsen måste vara minst 60x och dess numeriska bländare runt 1,3. Således måste gelerna vara relativt tunna (<50 μm), annars är pärlorna inte synliga eftersom de är över målets arbetsavstånd.
Huvudprotokollet består av tre sektioner: gelberedning, gelfunktionalisering och bildframställning; två avsnitt till är frivilliga och är dedikerade till antigenutvinningskvantering och avbildning av fluorescerande celler.
DEN TFM-metod som beskrivs här möjliggör en systematisk studie av B-cellernas aktiva mekaniska förmåga. I samband med B-celler är detta relaterat till förmågan att extrahera och internalisera antigenet. Jämfört med andra TFM-metoder, det protokoll som presenteras här är enkel och ganska reproducerbara: styvheten, mätt genom indrag av ett glas mikrosfär och med hjälp av Hertz modell, är mellan 400 och 600 Pa. Liknande protokoll har framgångsrikt använts inte bara för B-celler35 men också för T-celler36. I jämförelse med nanopillars (används även för T-lymfocyter37) det ger en plan homogen yta, därav resultaten är lättare att tolka som samspelet av gelen är främst begränsad för att vara tangentiell till ytan.
Det protokoll vi beskrev ger tillgång till spatiotemporal dynamiken i de krafter som utövas av B-celler på antigen-presentera substrat. På den rumsliga nivån ger detta information om lokalisering av krafter, och i kombination med fluorescensmikroskopi, gör det möjligt för försöksmaskinen att korrelera lokala krafter med förekomsten av specifika molekyler (dvs. komponenter i cytoskeleton eller BCR-signaleringskaskad). På tidsnivå är det möjligt att integrera mängder (såsom total energi eller total stress) för att ge ett värde per tidpunkt och minska bullret. Detta möjliggör observation av utvecklingen av dragkraften i tid (tillväxt och platå) och förekomsten av pulsatila mönster.
Kritiska experimentella aspekter för analysen beskrivs som följande. i) Celltäthet: för att utföra en korrekt analys bör celler vara tillräckligt åtskilda. Vi anser att en cell kan analyseras om den har en tom region av egen storlek runt den. ii) Transmissionsbild: det är lämpligt att samla in åtminstone en transmissionsbild av cellerna under det experiment som ska användas som mask i analysen. (iii) Antal pärlor i bilden: vi föreslår att analysera endast bilder där antalet pärlor i synapsen är mellan 30 och 200 (dvs. 1–8 pärlor/μm²). Lägre tätheter tillåter inte för adekvat karta förskjutning återuppbyggnad. Höga pärltätheter gör en partikelspårning opålitlig. iv) Antal pärlor bör vara konstant under försöket; fluktuationer kan dock uppstå på grund av små variationer i bildförhållandena (särskilt hos pärlor som ligger för nära varandra). Fokusavdrift, om inträffar, måste korrigeras och problematiska ramar bör kasseras. (v) Gelkvalitet: geler med för många sprickor, variabilitet i pärlorsfördelning eller geler som är för tjocka ska kasseras. vi Beroende på celltyp kan celler vid sena tidpunkter (>300 bildrutor) efter upprepade exponeringar drabbas av fototoxiska effekter. Det är lämpligt att köra programmet på en mask saknar celler som en “baslinje” som skall jämföras med data. Detta ger en magnitud av bullernivån enbart på grund av de experimentella förhållandena.
Geler som används för att mäta dragkraft i klassisk vidhäftning möjliggör för undersökning av processer som sker vid fokal adhesion (aktinflöden och rekrytering av signalmolekyler)—de punkter där krafter appliceras38,39. Dock är krafter vid synapsen inte tillämpas genom fokala sammanväxningar. Den spatiotemporal mönster av kraft generation vid B-cellen immun synaps har inte undersökts kvantitativt med denna metod tills nyligen. Använda TFM, observerade vi för första gången, kraft mönstrar vid B-cellen immun synaps, som presenteras i vår senaste studie6, öppna uppmuntrande perspektiv i studien av lymfocyter.
Noterbart är att denna metod använder en bild som tagits före ankomsten av cellerna på gelen som en referensbild för kraftuträkningen. Vanliga TFM-protokoll föreslår att referensbilden tas i slutet av experimentet, efter att ha löst cellerna med trypsin; detta gör att experimenter att leta efter en region rik på celler. Även om detta är möjligt även här, trypsin är ganska ineffektivt på att lossa B-celler från antigen-belagda gel, måste man vänta länge för lossnar och risken för gel modifiering och rörelser (som gör hela datamängden oexploiterbar) är högre.
Den metod som presenteras här är flexibel och kan tillämpas för att studera effekten av andra signaler vid immunsynapsen eftersom den möjliggör ympning av andra proteiner på gelytan (t.ex. integrin ligander och immunglobuliner har testats) och även fluorescerande antigen (se avsnitt 4). Dessutom är cellerna fortfarande tillgängliga för försöksflamenten för läkemedelsbehandling och lokala perturbations. Slutligen är metoden också kompatibel med bildframställning fasta celler. För dessa observationer rekommenderas att göra gelen på ett täckskydd, färga cellerna, limma täcket på en bild och först därefter lägga till monteringsmedia och en annan täckbild. Observation kommer sedan att ske med gelen på toppen för att undvika nedbrytning av bilden genom gelen.
Möjliga fallgropar är variabiliteten i gel i polymerisering och beläggning. Polymerisationsproblem beror främst på kvaliteten på initiator/katalysator. Även gelen kan blåsa upp, särskilt om den inte används direkt efter montering. Detta problem verkar inte dramatiskt påverka gelens mekaniska egenskaper, men det kan göra pärlskiktet oantagbart för målet, vilket effektivt gör gelen värdelös. Vi rekommenderar att man förbereder extra geler för varje tillstånd när detta problem visas. Det kan också finnas en viss variation i beläggningen, och det är viktigt att ha nyligen utspädd Sulfo SANPAH.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit en enkel, billig och reproducerbar metod för att mäta de krafter som utövas av B-celler vid den immunologiska synapsen när den aktiveras av BCR ligand. Den kan anpassas för att studera reaktionen på andra ligander och andra sorters lymfocyter (minnes B-celler, T-celler etc.) med användning av den rätta receptor liganden.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar M. Bolger-Munro för kritisk läsning och erkänner Nikon Imaging Center@CNRS-InstitutCurie och PICT-IBiSA, Institut Curie, Paris, medlem av France-BioImaging nationella forskningsinfrastruktur, för stöd i bild förvärv och Curie Animal Facility. PP stöddes av CNRS. AK och JP fick stöd av Paris Descartes PhD fellowship och Ecole Doctorale FIRE-Program Bettencourt. Detta projekt finansierades genom bidrag till PP (ANR-10-JCJC-1504-Immuphy) och AMLD (ANR-PoLyBex-12-BSV3-0014-001, ERC-Strapacemi-GA 243103).
3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store aliquoted, protected from humidity |
40% Acrylamide Solution | Biorad | 1610140 | |
Alexa555 microscale protein labeling kit | Molecular Probes | A30007 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
B cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | |
B-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
2% Bis Solution | Biorad | 161-0142 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100-812-C | |
Coverslip 18mm | VWR | 631-1580 | |
Fetal calf serum | PAA | A15-151 | Decomplemented (40min @56°C) |
Fluorodishes FD35 | World Precision Instruments, Inc | FD35100 | |
Fluosphere: carboxylate-modified, 0.2um, dark red | Molecular Probes | F8807 | |
Hen Egg Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Stocked in aliquote 100mg/ml |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermofisher/Gibco | 11140035 | |
N,N,N',N'-tetrametiletilendiammine (TEMED) | Euromedex | 50406-B | |
PBS (Phosfate Buffer Saline) | Gibco | 10010-015 | |
Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-010 | |
RMPI 1640 – Glutamax I | Thermofisher | 61870-010 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 |