Transkriptom-weite Profilierung von Protein-RNA-Wechselwirkungen durch Vernetzung und Immunpräzipitation durch FLAG-Biotin-Tandemreinigung

RNAs und RNA-bindende Proteine (RBPs) steuern verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich Spleißen, Translation, Ribosomenbiogenese, epigenetische Regulation und Zellschicksalübergang^1,2,3,4,5,6. Die empfindlichen Mechanismen dieser Prozesse hängen von der einzigartigen räumlichen und zeitlichen Anordnung von RNAs und RBPs ab. Daher besteht ein wichtiger Schritt zum Verständnis der RNA-Regulierung auf molekularer Ebene darin, die Positionsinformationen über die Bindungsstellen von RBPs aufzudecken.

Eine Strategie, die als Vernetzung und Immunpräzipation (CLIP-seq) bezeichnet wird, wurde entwickelt, um Protein-RNA-Wechselwirkungen mit UV-Vernetzung zu erfassen, gefolgt von Immunpräzipitation des von Interesse sindden Proteins⁷. Das Hauptmerkmal der Methodik ist die Induktion kovalenter Querverbindungen zwischen einem RNA-bindenden Protein und seinen direkt gebundenen RNA-Molekülen (innerhalb von 1 ° ) durch UV-Bestrahlung⁸. Die RBP-Footprints können durch CLIP-Tag-Clustering und Peak-Calling bestimmt werden, die in der Regel eine Auflösung von 30 bis 60 nt haben. Alternativ kann der umgekehrte Transkriptionsschritt von CLIP zu Indels (Einfügungen oder Deletionen) oder Substitutionen an den Vernetzungsstellen führen, was die Identifizierung von Proteinbindungsstellen auf den RNAs bei einer Einzigennukleotid-Auflösung ermöglicht. Für die Analyse der High-Throughput-Sequenzierungsergebnisse von CLIP-seq⁸wurden Pipelines wie Novoalign und CIMS entwickelt. Mehrere modifizierte CLIP-seq-Methoden wurden ebenfalls vorgeschlagen, darunter die Vernetzung der Individualnukleotid-Auflösung und die Immunpräzipation (iCLIP), verbesserte CLIP (eCLIP), irCLIP und photoaktivierbare ribonukleosidverstärkte Vernetzung und Immunpräzipation (PAR-CLIP)^9,10,11,12.

Trotz des breiten Einsatzes traditioneller CLIP-Seq-Methoden bei der Untersuchung von RBPs haben die CLIP-Methoden mehrere Nachteile. Erstens kann das mühsamde denaturierte Gelelektrophorese- und Membrantransferverfahren zu Informationsverlust führen und zu einer begrenzten Sequenzkomplexität führen. Zweitens kann die proteinspezifische CLIP-Methode einen Proteinkomplex anstelle eines einzelnen Zielproteins nach unten ziehen, was zu falsch positiven Protein-RNA-Wechselwirkungen aus den korifizierten RBPs führen kann. Drittens erfordert die Antikörper-basierte Strategie eine große Menge an hochwertigen Antikörpern, was die Anwendung dieser Methoden für die Untersuchung von RBPs ohne hochwertige Antikörper unzureichend macht. Viertens erfordert die traditionelle CLIP-Methode radioaktiv markierte ATP, um die proteingebundenen RNAs zu kennzeichnen.

Die hohe Affinität von Streptavidin zu biotinylierten Proteinen macht es zu einem sehr leistungsfähigen Ansatz, um bestimmte Proteine oder Proteinkomplexe zu reinigen. Die effiziente Biotinylierung von Proteinen, die eine künstliche Peptidsequenz durch ektopisch exprimierte bakterielle BirA-Biotinligase in Säugetierzellen tragen, macht es zu einer effizienten Strategie, Biotinreinigung in vivo¹³durchzuführen. Wir entwickelten eine modifizierte CLIP-seq-Methode namens ^FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin-mediated Cross-linking and Immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing) using FLAG-biotin tag tandem purification¹⁴ (Abbildung 1). Durch Tandemreinigung und strenge Waschbedingungen werden fast alle interagierenden RBPs entfernt (Abbildung 2). Die strengen Waschbedingungen ermöglichen auch die Umgehung des arbeitsintensiven und technisch anspruchsvollen SDS-PAGE- und Membrantransfers. Und ähnlich wie eCLIP und irCLIP ist die ^FbioCLIP-seq Methode isotopfrei. Das Überspringen der Gellauf- und Übertragungsschritte vermeidet den Verlust von Informationen, hält authentische Protein-RNA-Interaktionen intakt und erhöht die Bibliothekskomplexität. Darüber hinaus ist es durch die hohe Effizienz des Kennzeichnungssystems eine gute Wahl für RBPs ohne hochwertige Antikörper.

Hier finden Sie eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung des ^FbioCLIP-seq Protokolls für Säugetierzellen. Kurz gesagt, die Zellen sind durch 254 nm UV vernetzt, gefolgt von Zelllyse und FLAG-Immunpräzipitation (FLAG-IP). Als nächstes werden die Protein-RNA-Komplexe durch Biotin-Affinitätserfassung weiter gereinigt und RNAs durch partielle Verdauung mit MNase fragmentiert. Dann wird die proteingebundene RNA dephosphoryliert und mit einem 3′-Linker ligiert. Ein 5′-RNA-Linker wird hinzugefügt, nachdem die RNA mit PNK phosphoryliert und durch Proteinase-K-Verdauung eluiert wurde. Nach umgekehrter Transkription werden die proteingebundenen RNA-Signale durch PCR verstärkt und durch Agarose-Gel-Reinigung gereinigt. Zwei RBPs wurden ausgewählt, um das ^FbioCLIP-seq-Ergebnis zu veranschaulichen. LIN28 ist ein gut charakterisiertes RNA-bindendes Protein, das an der mikroRNA-Reifung, Proteintranslation und Zellreprogrammierung beteiligt ist^15,16,17. WDR43 ist ein WD40 domänenhaltiges Protein, das die Ribosomenbiogenese, die eukaryotische Transkription und die embryonale Stammzell-Pluripotenzkontrolle^14,18koordiniert. In Übereinstimmung mit den zuvor berichteten Ergebnissen für LIN28 mit CLIP-seq zeigt ^FbioCLIP-seq Bindungsstellen von LIN28 auf “GGAG”-Motiven in den microRNA mir-let7g und mRNAs^16,19 (Abbildung 3). WDR43 ^FbioCLIP-seq identifizierte auch die verbindliche Präferenz von WDR43 mit 5′ externen transkribierten Abstandshaltern (5′-ETS) von Pre-rRNAs²⁰ (Abbildung 4). Diese Ergebnisse bestätigen die Zuverlässigkeit der ^FbioCLIP-seq-Methode.