通过旗-生物素串联纯化通过交叉链接和免疫沉淀对蛋白质-RNA相互作用进行转录组-全过程分析

RNA和RNA结合蛋白（RBPs）控制不同的细胞过程，包括拼接、转化、核糖体生物生成、表观遗传调控和细胞命运过渡^{1、2、3、4、5、6。}这些过程的微妙机制取决于区域一项和成果数据库独特的空间和时间安排。因此，在分子水平上了解RNA调控的一个重要步骤是揭示RSP结合位点的位置信息。

一种称为交对和免疫沉淀（CLIP-seq）的策略已经开发出来，用于捕获蛋白质-RNA与UV交对的相互作用，然后是^{有关蛋白质的免疫沉淀7。}该方法的主要特点是通过紫外线照射8诱导RNA结合蛋白与其直接结合RNA分子（在+1+内）之间的共价交集^。RBP 足迹可以通过 CLIP 标记聚类和峰值调用确定，通常分辨率为 30~60 nt。或者，CLIP 的逆转录步骤可导致内德尔（插入或删除）或对交链接位点的替代，从而以单核苷酸分辨率识别RNA上的蛋白质结合位点。已开发出像Novoalign和CIMS这样的管道，用于分析S CLIP-seq⁸的高通量测序结果。还提出了几种经过修改的CLIP-seq方法，包括单核苷酸分辨率交叉链接和免疫沉淀（iCLIP）、增强的CLIP（eCLIP）、irCLIP和光活性核糖苷增强的交叉链接和免疫沉淀（PAR-CLIP）9、10、11、12。

尽管传统的 CLIP-seq 方法在 RBP 研究中应用广泛，但 CLIP 方法还是有几个缺点。首先，繁琐的变性凝胶电泳和膜传输过程可能导致信息丢失，并导致有限的序列复杂性。其次，基于蛋白质特异性抗体的 CLIP 方法可以拉下蛋白质复合物而不是单一靶蛋白，这可能导致来自共纯性 RBP 的假阳性蛋白-RNA 相互作用。 第三，基于抗体的策略需要大量的高质量抗体，这使得这些方法的应用不足以研究没有高质量抗体的 RBP。第四，传统的 CLIP 方法要求带放射性标签的 ATP 对蛋白结合的 RNA 进行标记。

链球菌素与生物素化蛋白质的高亲和力使它成为纯化特定蛋白质或蛋白质复合物的一种非常强大的方法。通过异位表达的细菌BirA生物素连接酶在哺乳动物细胞中携带人工肽序列的蛋白质进行有效的生物基化，使得它在体内进行生物素纯化^{成为有效的策略}。我们开发了一种改进的 CLIP-seq 方法，^{称为 Fbio}CLIP-seq（FLAG-生物锡介质Cross-l 墨迹和Immunop 恢复，然后是高通量测序） 使用 FLAG-biotin 标签串联纯化¹⁴ （图 1）.通过串联纯化和严格的洗涤条件，几乎所有相互作用的RSP被移除（图2）。严格的洗涤条件还允许规避SDS-PAGE和膜传输，这是劳动密集型和技术挑战。与黄道和伊尔克类似^，FbioCLIP-seq 方法不含同位素。跳过凝胶运行和转移步骤可避免信息丢失，保持正宗的蛋白质-RNA相互作用完好无损，并增加库的复杂性。此外，标记系统的高效率使它成为没有高质量抗体的 RBC 的一个很好的选择。

在这里，我们提供了哺乳动物细胞^{的 Fbio}CLIP-seq 协议的分步描述。简言之，细胞与254纳米紫外线交相关，其次是细胞解解和旗免疫沉淀（FLAG-IP）。接下来，蛋白质-RNA复合物通过生物素亲和力捕获进一步纯化，RNA通过MNase部分消化而分裂。然后，蛋白结合RNA被去磷酸化，并结合3’链接器。RNA与PNK磷酸化，并由蛋白酶K消化洗清后，加入5’RNA链接器。逆转录后，蛋白结合RNA信号通过PCR扩增，通过加糖凝胶纯化进行纯化。选择两个 RP 作为 Fbi^剪辑结果的典范。LIN28是一种具有良好特征的RNA结合蛋白，涉及微RNA成熟、蛋白质转化和细胞重新编程15、16、17。WDR43是一种含有WD40域的蛋白质，被认为可以协调核糖体生物生成、真核转录和胚胎干细胞多能控制^14、18。与之前报告的LIN28与 CLIP-seq的结果一致^，FbioCLIP-seq揭示了LIN28在微RNA mir-let7g和^{mRNA16，19（图}3）中”GGG”图案上的结合位点。WDR43 ^FbioCLIP-seq 还确定了 WDR43 与 5′ 外部转录空格 （5′ -ETS） 的预 rRNA²⁰的绑定首选项 （图 4）这些结果验证了^FbioCLIP-seq 方法的可靠性。