Infiltración de leucocitos del músculo cremaestro en ratones evaluado por microscopía intravital
Summary
Aquí, mostramos cómo realizar la microscopía intravital en los ventosos post-capilares del músculo cremaestro del ratón. Comúnmente aplicados a diferentes modelos de inflamación y sepsis, particularmente los inducidos por quimioquinas y citoquinas, destacamos su relevancia en el estudio de las muscolopatías que implican una infiltración exagerada de leucocitos musculares.
Abstract
La microscopía intravital (IVM) se utiliza ampliamente para monitorear los procesos fisiológicos y fisiopatológicos dentro de la cascada de reclutamiento de leucocitos in vivo. El protocolo actual representa un método práctico y reproducible para visualizar la interacción del leucocito endotelio que conduce al reclutamiento de leucocitos en el tejido derivado del músculo esquelético dentro del organismo intacto del ratón. El modelo es aplicable a todos los campos de investigación que se centran en la activación de granulocitos y su papel en la enfermedad.
Proporcionamos un protocolo paso a paso para guiar a través del método y resaltar posibles escollos y dificultades técnicas. El protocolo cubre los siguientes aspectos: ajustes experimentales y material requerido, anestesia del ratón, disección del músculo cremaestro, así como cánula traqueal y carótida, grabaciones de IVM y análisis fuera de línea. Los formatos de datos como leucocitos adherentes, flujo rodante (RF) y fracción de flujo rodante (RFF) se explican en detalle y se discuten las aplicaciones adecuadas. Los resultados representativos de los ratones mdx con deficiencia de distrofina se proporcionan en la sección de resultados.
IVM es una poderosa herramienta para evaluar el reclutamiento de leucocitos en un entorno in vivo; sin embargo, la delinear, por ejemplo, la función endotelial y leucocito puede requerir una combinación con configuraciones ex vivo como experimentos de cámara de flujo. Además, los antecedentes genéticos de los animales de interés pueden influir en gran medida en el reclutamiento de líneas de base, lo que requiere una afinación individual del protocolo proporcionado. A pesar de sus limitaciones, IVM puede servir como una plataforma para traducir fácilmente los hallazgos in vitro en un organismo vertebrado vivo.
Introduction
La microscopía intravital (IVM) es una herramienta comúnmente aplicada en el campo de la biología de leucocitos. El reclutamiento de leucocitos sigue una cascada de eventos bien definidos iniciados por la captura de leucocitos, laminación y adhesión a la pared endotelial, y finalmente la transmigración y extravasación de leucocitos al sitio real de la inflamación1. Cada paso está mediado y controlado por varias quimioquinas (por ejemplo, IL-8/CXCL8), receptores (por ejemplo, LFA-1, Mac-1) y las moléculas de adhesión de células endoteliales correspondientes (por ejemplo, ICAM-1, VCAM-1 y E-Selectin)2,3. La interacción de diferentes sitios reguladores, factores de control y mediadores de la cascada de reclutamiento de leucocitos como receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE), molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), ligando de motivo C-X-C (CXCL)1/2 y su receptor CXCR2 fueron descubiertos utilizando IVM4,5,6,7,8,9.
El método de La iVM se ha descrito para muchos órganos y tejidos diferentes como el intestino10,la piel11,los ganglios linfáticos12,el saco de yema embrionaria13 y otros. Sin embargo, el método más ampliamente estudiado de IVM es el modelo cremaster, descrito por primera vez en ratas14. Mientras que todavía se utiliza en ratas15, el método se aplica hoy en día principalmente en ratones debido a la alta abundancia de diferentes líneas transgénicas. Nuestro grupo ha destacado recientemente el papel potencial de la iVM de cremaster en el campo de las muscolopatías inflamatorias como la distrofia muscular de Duchenne (DMD) estudiando ratones mdx deficientes en distrofina16. Debido a su composición delgada entretejida y de fácil acceso de fibra, el músculo cremaestro representa el músculo candidato ideal para ser estudiado como un montaje completo utilizando la microscopía ligera o fluorescente. El reclutamiento y la extravasación de leucocitos se llevan a cabo principalmente en los ventosos post-capilares, que se pueden identificar fácilmente en una capa muscular continua en el músculo cremaestro.
La ventaja de la imagen in vivo en comparación con otros ensayos in vitro es su contexto biológico en un organismo vivo. Al mismo tiempo, la delinear contribuciones específicas de las células al reclutamiento alterado de leucocitos puede requerir modelos in vitro adicionales como cámaras de flujo o ensayos endoteliales. La combinación de múltiples métodos producirá datos más convincentes. Los científicos deben ser conscientes de las limitaciones del modelo cremaster, ya que cualquier manipulación quirúrgica conducirá a un aumento del tráfico y reclutamiento de leucocitos. Por lo tanto, el reclutamiento de referencia es difícil de estimar con este método. A pesar de su amplia aplicación, IVM del cremaster puede ser difícil y una configuración novedosa puede tomar tiempo y recursos para establecer. Ahora proporcionamos un protocolo fácil que ayudará a evitar algunos de los errores comunes en IVM. Además, se discutirán las limitaciones y se resaltarán los métodos complementarios cuando corresponda.
IVM del cremaster representa un enfoque ideal para ser implementado en el campo de los estudios inflamatorios e infecciosos. Más específicamente, el modelo cremaster puede ser de alto interés para los científicos que estudian la biología del músculo esquelético en el contexto de la enfermedad inflamatoria.
Protocol
Representative Results
Discussion
IVM como método se ha utilizado ampliamente para estudiar diferentes tipos de células en diferentes órganos y ha sido ampliamente descrito y discutido19. El objetivo principal de este estudio es proporcionar un enfoque eficiente para configurar y realizar IVM en el músculo cremaestro. La práctica del método producirá resultados fiables y reproducibles. Por lo tanto, la planificación y la estandarización son factores clave para dominar la técnica. Sobre todo, la técnica es muy dependient…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) 01GL1746E como parte del Consorcio PRIMAL. Los autores reconocen a Britta Heckmann y Silvia Pezer por su hábil asistencia técnica.
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
Referências
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