通过体内显微镜评估的小鼠中白细胞肌渗透
Summary
在这里，我们演示如何对小鼠排毛体肌肉的毛细管后静脉进行体内显微镜检查。通常适用于不同炎症和败血症的模型，特别是那些由化学因子和细胞因子引起的，我们强调其在研究肌肉白细胞渗透的肌肉病的相关性。
Abstract
体内显微镜（IVM）广泛用于监测体内白细胞招募级联内的生理和病理生理过程。目前的协议是一种实用且可重复的方法，用于可视化白细胞内皮相互作用，导致白细胞在小鼠完整有机体内的骨骼肌衍生组织中招募白细胞。该模型适用于所有研究领域，重点是颗粒细胞活化及其在疾病中的作用。
我们提供分步协议，以指导该方法，并突出潜在的陷阱和技术困难。该协议涵盖以下几个方面：实验设置和所需材料、小鼠麻醉、排骨肌解剖以及气管和胡萝卜罐、IVM 记录和离线分析。详细解释了粘附白细胞、滚动通量 （RF） 和滚动通量分数 （RFF） 等数据格式，并讨论了适当的应用。结果部分提供了肌营养不良mdx小鼠的代表性结果。
IVM是评估体内白细胞招募的有力工具;然而，例如内皮和白细胞功能，如果内皮和白细胞功能，可能需要与外活体设置（如流室实验）组合。此外，感兴趣的动物的遗传背景可能极大地影响基线的招募，需要个人对所提供的协议进行微调。尽管它有局限性，IVM可以作为一个平台，很容易将体外发现转化为活脊椎动物的有机体。
Introduction
宫内显微镜（IVM）是白细胞生物学领域常用的工具。白细胞招募遵循了由白细胞捕获、滚动和粘附到内皮壁引起的一系列明确事件，最后将白细胞迁移和外移到炎症1的实际部位。每个步骤由各种化学素（如IL-8/CXCL8）、受体（例如LFA-1、Mac-1）和相应的内皮细胞粘附分子（例如ICAM-1、VCAM-1和E-Selectin）进行调节2,和控制。,使用IVM,944、5、6、7、8、95,6,7发现不同调控部位、控制因子和调剂的相互作用，如高级甘化端产物受体（RAGE）、细胞间粘附分子1（ICAM-1）、C-X-C图案配体（CXCL）1/2及其受体CXCR2。8
IVM的方法被描述为许多不同的器官和组织，如肠道10，皮肤11，淋巴结12，胚胎蛋黄袋13等。然而，IVM研究最广泛的方法是在大鼠14中首次描述的克里马斯特模型。虽然这种方法仍然用于大鼠15，但由于不同转基因系的丰度高，目前主要应用于小鼠。我们的团队最近强调了排泄物IVM在炎症性肌肉病领域的潜在作用，如杜琴肌肉萎缩症（DMD），研究肌营养不良的mdx小鼠16。由于其薄交织和易于访问的纤维组成，排泄肌代表理想的候选肌肉，用于使用光或荧光显微镜作为整个坐骑进行研究。白细胞的招募和外征主要发生在毛细管后静脉，这可以很容易地识别在连续肌肉层在排骨肌肉。
与其他体外检测相比，体内成像的优点是其生物环境在活的有机体中。同时，对改变的白细胞招募进行细胞特异性贡献可能需要额外的体外模型，如流室或内皮测定。多种方法的组合将产生最令人信服的数据。科学家应该意识到排泄剂模型的局限性，因为任何手术操作都会导致白细胞贩运和招募的增加。因此，很难用这种方法估计基线征聘。尽管它有着广泛的应用，但 cremaster 的 IVM 可能具有挑战性，而一个新设置可能需要时间和资源才能建立。现在，我们提供了一个简单的协议，这将有助于避免IVM中的一些常见错误。此外，还将讨论限制，并在适用时突出显示免费方法。
排泄物的IVM是炎症和传染性研究领域实施的理想方法。更具体地说，在炎症性疾病的背景下，研究骨骼肌生物学的科学家可能对此非常感兴趣。
Protocol
Representative Results
Discussion
IVM作为一种研究不同器官不同细胞类型的方法得到了广泛的应用，并被广泛地描述和讨论了19。本研究的主要目的是提供一种有效的方法，在肌肉的肌肉中设置和执行IVM。实践该方法会产生可靠且可重现的结果。因此，规划和标准化是掌握该技术的关键因素。最重要的是，该技术非常依赖于血液动力学和微血管参数，需要密切监测和控制。因此，不同组之间的系统动力学会产生?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了德国联邦教育和研究部（BMBF）01GL1746E的支持，作为PRIMAL联盟的一部分。作者承认布里塔·赫克曼和西尔维娅·佩泽提供了娴熟的技术援助。
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
Referências
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