세균성 윌트 질병의 간단한 유전 분석을 위한 랄스토니아 솔라나세아룸에 의한 접종에 이어 토마토 뿌리 변환
Summary
여기에서, 우리는 세균성 wilt 질병의 연구 연구를 위한 간단한 유전 분석을 능력을 발휘하기 위하여 랄스토니아 solanacearum를 가진 접종에 선행된 토마토 뿌리 변환을 위한 다재다능한 방법을 제시합니다.
Abstract
랄스토니아 솔라나세아룸은 광범위한 식물 종을 감염시켜 농업에 중요한 위협을 야기할 수 있는 파괴적인 토양 매개 혈관 병원체입니다. 그러나, Ralstonia 모형은 애기장대에있는 슈도모나스 주사기와 같은 세균성 식물 병원체를 관련시키는 그밖 모형에 비해 상당히 미개척입니다. 랄스토니아와 작물 식물 사이의 상호 작용을 이해하는 것을 목표로 연구는 세균성 wilt 질병에 맞서 싸울 수있는 지속 가능한 솔루션을 개발하는 데 필수적이지만 현재 네이티브 호스트 식물에서 상호 작용의 다른 구성 요소를 특성화하는 간단한 실험 분석의 부족에 의해 방해된다. 이 시나리오에서는, 우리는 토마토의 랄스토니아 감염의 유전 분석을 수행하는 방법을 개발했다, 랄스토니아의자연 호스트. 이 방법은 아그로박테리움 뿌리줄기-매개형질전환, 그 다음에 생성된 식물의 랄스토니아 토양-흠뻑 적시성 접종, 관심의 구성을 표현하는 형질전환 뿌리를 함유한다. 근형 형질분석법의 다양성은 RNAi에 의해 매개된 유전자 과발현 또는 유전자 침묵을 능력을 발휘할 수 있게 한다. 개념의 증거로, 우리는 RNAi 매개 토마토 뿌리에서 SlCESA6의 침묵이 랄스토니아에저항을 부여 것을 보여주기 위해이 방법을 사용 . 여기에서는 이 방법을 자세히 설명하여 비교적 짧은 시간 및 장비 및 식물 성장 공간의 작은 요구 사항으로 세균성 질병을 이해하는 유전 적 접근법을 가능하게합니다.
Introduction
Ralstonia solanacearum,세균성 wilt 질병의 인과 에이전트는, 감자, 토마토, 담배, 바나나, 후추 및 가지를 포함하여 식물 종의 큰 범위를 감염시킬 수 있는 세계적인 분포를 가진 파괴적인 토양 품어진 혈관 병원체, 그 외의 사이에서1,,2. 랄스토니아에 의한 수율 손실은 품종, 기후, 토양 및 기타 요인에 따라 토마토, 감자 또는 바나나생산의 80-90 %에 도달 할 수 있습니다3. 그러나, 랄스토니아 모델은 슈도모나스 주사기 또는 산토모나스 종과같은 세균성 식물 병원균을 포함하는 다른 모델과 비교하여 상당히 미개척이다. 추가적으로, 식물 미생물 상호 작용에 있는 대부분의 연구 결과는 모델 식물 애기장대 탈리아나에 집중됩니다. 비록 이러한 모델을 사용 하 여 연구는 크게 식물-박테리아 상호 작용의 우리의 이해에 기여, 그들은 작물 식물에서 이러한 상호 작용을 이해 하는 현재 필요성을 해결 하지 않습니다. 랄스토니아와 작물 식물 사이의 상호 작용을 이해하는 것을 목표로 연구는 세균성 wilt 질병에 맞서 싸울 수있는 지속 가능한 솔루션을 개발하는 데 필수적이지만 현재 상호 작용의 다른 구성 요소를 특성화하는 간단한 실험 분석의 부족에 의해 방해된다. 특히, 랄스토니아의천연 숙주인 토마토는 전 세계적으로 두 번째로 중요한 채소 작물이며 세균성 질병을 포함한 과다한 질병4의영향을 받습니다. 이 작품에서, 우리는 토마토의 랄스토니아 감염의 유전자 분석을 수행하는 쉬운 방법을 개발했다. 이 방법은 Agrobacterium 뿌리 줄기-중재 된 토마토 뿌리의 매개 형질에 기초하여, 선택 마커5로DsRed 형광을 사용하여, 그 결과 식물의 랄스토니아 토양 흠뻑 접종, 관심의 구성을 표현하는 변형 뿌리를 포함. 근형 형질분석법의 다양성은 RNAi에 의해 매개된 유전자 과발현 또는 유전자 침묵을 능력을 발휘할 수 있게 한다.
이 방법의 잠재적 제한은 변형되지 않은 뿌리의 잔류 성장에 있습니다. 이것은 플라스미드가 사용된 경우에 특히 중요합니다 형질전환된 뿌리의 선택을 허용하는 리포터 유전자가 결여됩니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 건강한 항생제 내성 형질전환 뿌리의 성장을 허용하면서 비 형질전환 뿌리의 성장을 억제하는 항생제 선택에 기초한 대체 방법을 개발했습니다. A. 뿌리 줄기 유전자는 싹의 변형을 유발하지 않기 때문에 항생제에 취약하므로 항생제 함유 배지와 분리되어 보관해야합니다.
랄스토아에 대한 식물 저항이 잘 이해되지 않지만, 여러 보고서는 세균 윌트6,7,7,8,,9에대한 향상된 저항에 세포벽 변경을 연관시켰습니다. 이러한 세포벽 변경이 혈관 발달에 영향을 미친다는 것이 제안되었으며, 이는 식물10내부의 랄스토니아 의 생활 방식에 필수적인 측면입니다. 애기장대에서 셀룰로오스 synthases CESA4, CESA7 및 CESA8을 코딩하는 유전자의 돌연변이는 이차 세포벽 무결성을 손상시키는 것으로 나타났으며, 이는 ABA신호8에연결된 것으로 보이는 랄스토니아에대한 향상된 저항성을 유발한다. 따라서, 우리의 방법에 대한 개념의 증거로, 우리는 SlCESA6의 RNAi 매개 유전자 침묵(Solyc02g072240),이차 세포 벽 셀룰로오스 synthase, 및 AtCESA8의 직교(At4g18780)를수행했다. 랄스토니아와 후속 토양 흠뻑 접종은 SlCESA6 침묵 세균성 시류 증상에 대한 저항을 강화 것으로 나타났다, 랄스토니아에 세포 벽 매개 저항가능성이 토마토에 보존 제안, 토마토 뿌리에서 세균 윌트 저항의 유전자 분석을 수행하는 우리의 방법을 검증. 여기에서는 이 방법을 자세히 설명하여 비교적 짧은 시간 및 장비 및 식물 성장 공간의 작은 요구 사항으로 세균성 질병을 이해하는 유전 적 접근법을 가능하게합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
랄스토니아 솔라나세아룸은 농업에 중요한 위협이 됩니다. 그러나, 농업 중요성의 자연 호스트와의 상호 작용은 여전히 제대로 다른 세균성 병원 체에 비해 이해, 특히 작물 식물 종에. 대부분의 경우, 유전 분석은 호스트 식물을 유전적으로 수정하는 데 필요한 시간과 비용에 의해 방해됩니다. 이러한 문제를 해결하고 토마토에 있는 R. solanacearum 감염의 유전 분석을 용이하게 하기 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 유용한 토론에 대한 마초 실험실의 모든 실험실 구성원, 통계 적 조언 알바로 로페즈 – 가르시아, 이 작업 중에 기술 및 관리 지원을 위한 신유 지안에게 감사드립니다. 우리는 형광 이미징에 대한 지원을 위한 PSC 세포 생물학 핵심 시설에 감사드립니다 이 작품은 중국 과학 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램 (부여 XDB27040204), 식물 스트레스 생물학을위한 상하이 센터 (중국어)에 의해 지원되었습니다. 과학 아카데미) 및 중국 1000 인재 프로그램.
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
Referências
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