Summary

Trasformazione della radice di pomodoro seguita da inoculazione con Ralstonia Solanacearum per un'analisi genetica diretta della malattia batterica di Wilt

Published: March 11, 2020
doi:

Summary

Qui, presentiamo un metodo versatile per la trasformazione della radice di pomodoro seguito da inoculazione con Ralstonia solanacearum per eseguire un’analisi genetica semplice per lo studio della malattia dell’avvizzimento batterico.

Abstract

Ralstonia solanacearum è un devastante patogeno vascolare portato sul suolo che può infettare una vasta gamma di specie vegetali, causando un’importante minaccia per l’agricoltura. Tuttavia, il modello ralstonia è notevolmente sottoesplorato rispetto ad altri modelli che coinvolgono patogeni vegetali batterici, come le siringhe Pseudomonas de Arabidopsis. La ricerca mirata a comprendere l’interazione tra Ralstonia e piante da coltura è essenziale per sviluppare soluzioni sostenibili per combattere le malattie dell’avvistamento batterico, ma è attualmente ostacolata dalla mancanza di semplici analisi sperimentali per caratterizzare i diversi componenti dell’interazione nelle piante ospiti native. In questo scenario, abbiamo sviluppato un metodo per eseguire l’analisi genetica dell’infezione da Ralstonia del pomodoro, un ospite naturale di Ralstonia. Questo metodo si basa sulla trasformazione mediata di radici di pomodoro agrobacterium rhizogenes,seguita dall’inoculazione del suolo ralstonia delle piante risultanti, contenente radici trasformate che esprimono il costrutto di interesse. La versatilità dell’analisi della trasformazione della radice consente di eseguire la sovraespressione genica o il silenziamento genico mediato dall’RNAi. Come prova di concetto, abbiamo usato questo metodo per dimostrare che il silenziamento mediato dall’RNAi di SlCESA6 nelle radici di pomodoro ha conferito resistenza a Ralstonia. Qui, descriviamo questo metodo in dettaglio, consentendo agli approcci genetici di comprendere la malattia dell’avvizzimento batterico in un tempo relativamente breve e con piccoli requisiti di attrezzature e spazio di crescita delle piante.

Introduction

Ralstonia solanacearum, l’agente causale della malattia dell’avvistamento batterico, è un devastante patogeno vascolare del suolo con una distribuzione mondiale che può infettare una vasta gamma di specie vegetali, tra cui patate, pomodoro, tabacco, banana, pepe e melanzane, tra gli altri1,2. Le perdite di rendimento causate da Ralstonia possono raggiungere l’80-90% della produzione di pomodoro, patate o banane, a seconda della cultivar, del clima, del suolo e di altri fattori3. Tuttavia, il modello Ralstonia è notevolmente poco esplorato rispetto ad altri modelli che coinvolgono patogeni vegetali batterici, come Pseudomonas siringae o Xanthomonas spp. Inoltre, la maggior parte degli studi sulle interazioni pianta-microbo si concentra sulla pianta modello Arabidopsis thaliana. Anche se la ricerca che utilizza questi modelli ha ampiamente contribuito alla nostra comprensione delle interazioni piante-batteri, non affrontano l’attuale necessità di comprendere queste interazioni nelle piante da coltura. La ricerca mirata a comprendere l’interazione tra Ralstonia e piante da coltura è essenziale per sviluppare soluzioni sostenibili per combattere le malattie dell’avvistamento batterico, ma è attualmente ostacolata dalla mancanza di semplici analisi sperimentali per caratterizzare i diversi componenti dell’interazione. In particolare, il pomodoro, un ospite naturale per Ralstonia, è la seconda coltura vegetale più importante al mondo ed è colpita da una pletora di malattie4, tra cui la malattia di avvizzimento batterico. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un metodo semplice per eseguire l’analisi genetica dell’infezione da Ralstonia del pomodoro. Questo metodo si basa sulla trasformazione mediata agrobacterium rhizogenesdelle radici di pomodoro, utilizzando la fluorescenza DsRed come marcatore di selezione5, seguita dall’inoculazione del suolo di Ralstonia delle piante risultanti, contenente radici trasformate che esprimono il costrutto di interesse. La versatilità dell’analisi della trasformazione della radice consente di eseguire la sovraespressione genica o il silenziamento genico mediato dall’RNAi.

Una potenziale limitazione di questo metodo consiste nella crescita residua di radici non trasformate. Ciò è particolarmente importante nei casi in cui il plasmico usato manca di un gene reporter che consenta la selezione delle radici trasformate. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un metodo alternativo basato sulla selezione degli antibiotici, che inibisce la crescita di radici non trasformate, consentendo la crescita di radici trasformate sane resistenti agli antibiotici. Poiché A. i rizogeni non inducono la trasformazione dei germogli, sono suscettibili all’antibiotico e, pertanto, dovrebbero essere tenuti separati dal mezzo contenente antibiotici.

Anche se la resistenza alle piante contro Ralstonia non è ben compresa, diversi rapporti hanno associato alterazioni della parete cellulare a una maggiore resistenza all’appassimento batterico6,7,8,9.9 È stato suggerito che queste alterazioni della parete cellulare influenzano lo sviluppo vascolare, un aspetto essenziale per lo stile di vita di Ralstonia all’interno della pianta10. Le mutazioni nei geni che codificano la cellulosa sintetizzano CESA4, CESA7 e CESA8 de Arabidopsis thaliana hanno dimostrato di compromettere l’integrità della parete cellulare secondaria, causando una maggiore resistenza a Ralstonia, che sembra essere collegato alla segnalazione ABA8. Therefore, as a proof of concept for our method, we performed RNAi-mediated gene silencing of SlCESA6 (Solyc02g072240), a secondary cell-wall cellulose synthase, and ortholog of AtCESA8 (At4g18780). La successiva inoculazione del suolo con Ralstonia ha mostrato che il silenziamento di SlCESA6 ha migliorato la resistenza di SlCESA6 ai sintomi dell’avvizzimento batterico, suggerendo che la resistenza mediata dalla parete cellulare a Ralstonia è probabilmente conservata nel pomodoro e convalidando il nostro metodo per effettuare analisi genetiche della resistenza batterica delle wilt nelle radici del pomodoro. Qui, descriviamo questo metodo in dettaglio, consentendo agli approcci genetici di comprendere la malattia dell’avvizzimento batterico in un tempo relativamente breve e con piccoli requisiti di attrezzature e spazio di crescita delle piante.

Protocol

NOTA: Parti importanti di questo metodo riguardano la movimentazione di materiali vegetali in vitro, e quindi è importante mantenere le condizioni sterili durante tutte queste procedure, compresa la visualizzazione della fluorescenza DsRed. Durante tutto il processo di trasformazione, le piantine di pomodoro crescono a 25-28 gradi centigradi e 16 h/8 h luce/scuro (130 fotoni mol m-2s-1 luce). Le piastre sono sigillate con nastro microporo per facilitare lo scambio di gas e la tras…

Representative Results

La figura 5 mostra lo sviluppo dei sintomi della malattia delle piante di pomodoro con radici trasformate con un vettore vuoto (EV) e di piante con radici trasformate con un costrutto RNAi destinato a SlCESA6 (Solyc02g072240). I dati dell’indice della malattia (Figura 5A) vengono raccolti dalla stessa unità sperimentale (ogni impianto) nel tempo secondo una scala arbitraria da 0 a 4 e non seguo…

Discussion

Il Ralstonia solanacearum rappresenta una minaccia importante per l’agricoltura; tuttavia, la sua interazione con ospiti naturali di importanza agricola è ancora poco compresa rispetto ad altri patogeni batterici, specialmente nelle specie vegetali delle colture. Nella maggior parte dei casi, l’analisi genetica è ostacolata dal tempo e dalle spese necessarie per modificare geneticamente le piante ospiti. Per risolvere questo problema e facilitare l’analisi genetica dell’infezione da R. solanacearum ne…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Macho per le discussioni utili, Alvaro Lopez-Garcoa per la consulenza statistica e Xinyu Jian per l’assistenza tecnica e amministrativa durante questo lavoro. Ringraziamo la struttura centrale di PSC Cell Biology per assistenza con l’imaging a fluorescenza Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca Sulla Priorità Strategica dell’Accademia Cinese delle Scienze (grant XDB27040204), lo Shanghai Center for Plant Stress Biology (Cinese Academy of Sciences) e il programma cinese 1000 Talents.

Materials

90 mm square Petri-dishes
Agar powder Sigma-Aldrich
Bacto peptone BD (Becton and Dickinson)
Casamino acids Sigma-Aldrich
Filter paper
In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 Berthold Technologies
Jiffy pots Jiffy Products International A.S.
Micropore tape 3M
Murashige and Skoog medium (M519) Phytotechlab
Pindstrup substrate Pindstrup Mosebrug A/S
Scalpel and blade
Sodium hypochlorite Sigma-Aldrich
Sterile clean bench
Tweezers
Wahtman paper Wahtman International Ltd. Maldstone
Yeast extract OXOID

Referências

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Citar este artigo
Morcillo, R. J. L., Zhao, A., Tamayo-Navarrete, M. I., García-Garrido, J. M., Macho, A. P. Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease. J. Vis. Exp. (157), e60302, doi:10.3791/60302 (2020).

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