Transformación de raíz de tomate Seguida de inoculación con Ralstonia Solanacearum para el análisis genético directo de la enfermedad bacteriana de Wilt
Summary
Aquí, presentamos un método versátil para la transformación de la raíz de tomate seguido de la inoculación con Ralstonia solanacearum para realizar un análisis genético sencillo para el estudio de la enfermedad bacteriana de la enfermedad de wilt.
Abstract
Ralstonia solanacearum es un patógeno vascular devastador que puede infectar a una amplia gama de especies vegetales, causando una amenaza importante para la agricultura. Sin embargo, el modelo Ralstonia está considerablemente infraexplorado en comparación con otros modelos que involucran patógenos vegetales bacterianos, como Pseudomonas syringae pt Arabidopsis. La investigación dirigida a comprender la interacción entre Ralstonia y las plantas de cultivo es esencial para desarrollar soluciones sostenibles para luchar contra la enfermedad bacteriana de la inejique, pero actualmente se ve obstaculizada por la falta de ensayos experimentales sencillos para caracterizar los diferentes componentes de la interacción en las plantas anfitrionas nativas. En este escenario, hemos desarrollado un método para realizar análisis genéticos de la infección por Ralstonia de tomate, un huésped natural de Ralstonia. Este método se basa en la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenesde las raíces de tomate, seguida de la inoculación de Ralstonia soil-drenching de las plantas resultantes, que contiene raíces transformadas que expresan la construcción de interés. La versatilidad del ensayo de transformación de raíz permite realizar una sobreexpresión genética o un silenciamiento de genes mediado por el ARNI. Como prueba de concepto, utilizamos este método para demostrar que el silenciamiento mediado por ARNi de SlCESA6 en raíces de tomate confirió resistencia a Ralstonia. Aquí, describimos este método en detalle, permitiendo enfoques genéticos para entender la enfermedad de marchitamiento bacteriano en un tiempo relativamente corto y con pequeños requisitos de equipo y espacio de crecimiento de la planta.
Introduction
Ralstonia solanacearum, agente causal de la enfermedad bacteriana de wilt, es un patógeno vascular devastador transmitido por el suelo con una distribución mundial que puede infectar una amplia gama de especies vegetales, incluyendo papa, tomate, tabaco, plátano, pimienta y berenjena, entre otros1,2. Las pérdidas de rendimiento causadas por Ralstonia pueden alcanzar el 80-90% de la producción en tomate, patata o plátano, dependiendo del cultivar, clima, suelo y otros factores3. Sin embargo, el modelo Ralstonia está considerablemente infraexplorado en comparación con otros modelos que involucran patógenos vegetales bacterianos, como Pseudomonas syringae o Xanthomonas spp. Además, la mayoría de los estudios en interacciones entre plantas y microbios se centran en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Aunque la investigación utilizando estos modelos ha contribuido en gran medida a nuestra comprensión de las interacciones entre plantas y bacterias, no abordan la necesidad actual de entender estas interacciones en las plantas de cultivo. La investigación dirigida a comprender la interacción entre Ralstonia y las plantas de cultivo es esencial para desarrollar soluciones sostenibles para luchar contra la enfermedad bacteriana de la inejique, pero actualmente se ve obstaculizada por la falta de ensayos experimentales sencillos para caracterizar los diferentes componentes de la interacción. Particularmente, el tomate, un huésped natural de Ralstonia,es el segundo cultivo vegetal más importante a nivel mundial y se ve afectado por una plétora de enfermedades4,incluida la enfermedad bacteriana de wilt. En este trabajo, hemos desarrollado un método fácil para realizar análisis genéticos de la infección por Ralstonia del tomate. Este método se basa en la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenesde las raíces de tomate, utilizando la fluorescencia DsRed como marcador de selección5,seguido de la inoculación de Ralstonia soil-drenching de las plantas resultantes, que contiene raíces transformadas que expresan la construcción de interés. La versatilidad del ensayo de transformación de raíz permite realizar una sobreexpresión genética o un silenciamiento de genes mediado por el ARNI.
Una limitación potencial de este método consiste en el crecimiento residual de raíces no transformadas. Esto es particularmente importante en los casos en que el plásmido utilizado carece de un gen reportero que permita la selección de raíces transformadas. Para resolver este problema, hemos desarrollado un método alternativo basado en la selección de antibióticos, que inhibe el crecimiento de raíces no transformadas al tiempo que permite el crecimiento de raíces transformadas sanas resistentes a los antibióticos. Dado que A. rhizogenes no induce la transformación de los brotes, son susceptibles al antibiótico y, por lo tanto, deben mantenerse separados del medio que contiene antibióticos.
Aunque la resistencia de las plantas contra Ralstonia no se entiende bien, varios informes han asociado alteraciones de la pared celular a una mayor resistencia a la marchitabacteriana6,,7,8,9. Se ha sugerido que estas alteraciones de la pared celular afectan el desarrollo vascular, un aspecto esencial para el estilo de vida de Ralstonia dentro de la planta10. Se ha demostrado que las mutaciones en genes que codifican las sinteas de celulosa CESA4, CESA7 y CESA8 pt Arabidopsis thaliana afectan la integridad de la pared celular secundaria, causando una mayor resistencia a Ralstonia,que parece estar vinculada a la señalización ABA8. Por lo tanto, como prueba de concepto para nuestro método, realizamos silenciamiento de genes mediado por ARNi de SlCESA6 (Solyc02g072240), una celulosa de pared celular secundaria sintasa, y ortolog de AtCESA8 (At4g18780). La posterior inoculación de drenado del suelo con Ralstonia mostró que silenciar SlCESA6 mejoró la resistencia a los síntomas de marchitamiento bacteriano, lo que sugiere que la resistencia mediada por la pared celular a Ralstonia probablemente se conserva en el tomate, y validando nuestro método para llevar a cabo análisis genéticos de la resistencia bacteriana a la marchitamiento en las raíces del tomate. Aquí, describimos este método en detalle, permitiendo enfoques genéticos para entender la enfermedad de marchitamiento bacteriano en un tiempo relativamente corto y con pequeños requisitos de equipo y espacio de crecimiento de la planta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ralstonia solanacearum representa una amenaza importante para la agricultura; sin embargo, su interacción con los huéspedes naturales de importancia agrícola todavía se entiende mal en comparación con otros patógenos bacterianos, especialmente en especies de plantas de cultivo. En la mayoría de los casos, el análisis genético se ve obstaculizado por el tiempo y los gastos necesarios para modificar genéticamente las plantas anfitrionas. Para abordar este problema y facilitar el análisis genético de la…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Macho por sus útiles debates, a Alvaro López-García por el asesoramiento estadístico y a Xinyu Jian por su asistencia técnica y administrativa durante este trabajo. Agradecemos a la instalación central de Biología Celular del PSC por la asistencia con la imagen por fluorescencia Este trabajo fue apoyado por el Programa Estratégico de Investigación Prioritaria de la Academia China de Ciencias (concesión XDB27040204), el Centro de Shanghai para biología del estrés vegetal (chino Academia de Ciencias) y el programa chino 1000 Talents.
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
Referências
- Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. . The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).
- Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. . Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Wydra, K., Beri, H. Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).
- Wydra, K., Beri, H. Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).
- Hernández-Blanco, C., et al. Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance. Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).
- Denancé, N., et al. Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism. Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).
- Digonnet, C., et al. Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall. Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).
- Sang, Y., et al. The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).
- Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts. New Phytologist. 192, 976-987 (2011).
- Wang, K., et al. Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum. Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling. Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).
- Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. Retire statistical significance. Nature. 567, 305-307 (2019).
