Summary

Migración, Chemo-Atracción, y Co-Cultura Ensayos para Células Endoteliales Derivadas de Células Madre Humanas y Neuronas GABAérgicas

Published: January 23, 2020
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Summary

Presentamos tres ensayos simples in vitro: el ensayo de migración de larga distancia, el ensayo de migración de cocultura y el ensayo de quimio-atracción, que evalúan colectivamente las funciones de las células endoteliales periventriculares derivadas de células madre humanas y sus interacción con las interneuronas GABAérgicas.

Abstract

Papel de la vasculatura cerebral en el desarrollo del sistema nervioso y etiología de los trastornos cerebrales está ganando cada vez más atención. Nuestros estudios recientes han identificado una población especial de células vasculares, las células endoteliales periventriculares, que desempeñan un papel crítico en la migración y distribución de las interneuronas GABAérgicas prefálico durante el desarrollo embrionario. Esto, junto con sus funciones celulares-autónomas, alude a nuevos roles de células endoteliales periventriculares en la patología de trastornos neuropsiquiátricos como la esquizofrenia, la epilepsia y el autismo. Aquí, hemos descrito tres diferentes ensayos in vitro que evalúan colectivamente las funciones de las células endoteliales periventriculares y su interacción con las interneuronas GABAérgicas. El uso de estos ensayos, particularmente en un contexto humano, nos permitirá identificar el vínculo entre las células endoteliales periventriculares y los trastornos cerebrales. Estos ensayos son simples, de bajo costo y reproducibles, y se pueden adaptar fácilmente a cualquier tipo de célula adherente.

Introduction

Las células endoteliales forman el revestimiento de los vasos sanguíneos y median funciones importantes que incluyen el mantenimiento de la permeabilidad de la pared de los vasos sanguíneos, la regulación del flujo sanguíneo, la agregación plaquetaria y la formación de nuevos vasos sanguíneos. En el cerebro, las células endoteliales forman parte de una barrera hematoencefálica crítica que controla estrechamente el intercambio de materiales entre el cerebro y el torrente sanguíneo1. Nuestros estudios en la última década han identificado nuevos roles neurogénicos de las células endoteliales cerebrales que tienen implicaciones significativas para el desarrollo y el comportamiento cerebral2,3,4,5. Hemos demostrado que el cerebro embrionario del ratón está vascularizado por dos subtipos distintos de vasos, los vasos piales y los vasos periventriculares, que difieren en anatomía, origen y perfil de desarrollo2. Las células endoteliales que recubren estos dos subtipos de recipientes muestran diferencias claras en sus perfiles de expresión génica. Mientras que las células endoteliales piales en su mayoría expresan genes relacionados con la inflamación y la respuesta inmune, las células endoteliales periventriculares se enriquecen de forma única en la expresión de genes comúnmente asociados con neurogénesis, migración neuronal, quimiotaxis y orientación de axón3. Células endoteliales periventriculares también albergan una novedosa vía de señalización GABA que es distinta de la vía de señalización GABA neuronal tradicional5. Concomitante con su expresión génica, se encontraron células endoteliales periventriculares para regular la migración y distribución de las interneuronas GABAérgicas en el neocórtex en desarrollo. Durante el desarrollo embrionario, las células endoteliales periventriculares se someten a migración a larga distancia a lo largo de un gradiente ventral-dorsal para establecer la red vascular periventricular2,3. Esta ruta migratoria es reflejada un día después por las interneuronas. Las interneuronas migratorias interactúan físicamente con la red vascular periventricular preformada y la utilizan como guía para llegar a su destino final en el neocórtex. Además de actuar como un sustrato físico, las células endoteliales periventriculares sirven como la fuente de señales de navegación para las neuronas migratorias. GABA secreto celular endotelial periventricular guía la migración interneurony regula sus patrones de distribución final4. Los defectos en la migración y distribución interneurona se asocian con trastornos neuropsiquiátricos como autismo, epilepsia, esquizofrenia y depresión6,7,8,9,10. Por lo tanto, el estudio de las funciones de las células endoteliales periventriculares y su influencia en la migración interneuronal en el contexto humano se vuelve fundamental para abordar la patogénesis de estos trastornos.

Hemos generado células endoteliales periventriculares humanas a partir de células madre embrionarias humanas en nuestro laboratorio11,utilizando la tecnología inducida de células madre pluripotentes (iPSC)12,13. Para validar si las células endoteliales periventriculares humanas imitan fielmente las células endoteliales periventriculares del ratón, y para evaluar cuantitativamente su influencia en la migración interneuronica, desarrollamos tres ensayos in vitro: un ensayo de migración a larga distancia, un ensayo de migración de cocultivo y un ensayo de quimio-atracción. Aquí describimos los protocolos para estos ensayos en detalle. Los tres ensayos se basan en el uso de inserciones de cultivo de silicona para crear un pequeño parche rectangular de celdas (de dimensiones fijas) rodeados de espacio libre de celdas. La distancia de migración se evalúa midiendo la distancia entre las posiciones finales de las celdas desde el borde del parche rectangular que se ha descrito el día 0. En el ensayo de migración de larga distancia, las células endoteliales periventriculares humanas se sembran como un parche en el centro de un plato de 35 mm, y se calculan las distancias recorridas por las células durante un largo rango de tiempo. En el ensayo de migración de cocultivo, las células endoteliales periventriculares humanas se co-sembran con interneuronas humanas como un parche en un plato de 35 mm. Esta configuración permite examinar el efecto de las interacciones físicas directas de estos dos tipos de células en la tasa de migración de las interneuronas. El ensayo de quimio-atracción mide la migración de las interneuronas en respuesta a las señales quimio-atractivas secretadas por las células endoteliales periventriculares humanas. Las interneuronas se sembran como un parche rectangular, con células endoteliales periventriculares humanas y controlar las células endoteliales no periventriculares sembradas como parches de tamaño similar a ambos lados. Cada uno de los parches celulares están separados por una brecha libre de células de 500 m. La respuesta de las interneuronas se evalúa cuantificando el número de células que han migrado hacia las células endoteliales periventriculares en comparación con el control de las células endoteliales no periventriculares.

Estos ensayos proporcionan una evaluación sólida de las funciones de las células endoteliales periventriculares humanas y su influencia en la migración interneuronal. La novedosa configuración del ensayo de larga distancia y el ensayo de migración de cocultura proporciona espacio libre de células en el rango de centímetros (1-1,5 cm) para permitir la detección de la migración de larga distancia. En la Tabla 1se presenta un resumen de las características de nuestros ensayos en comparación con otros ensayos populares. Colectivamente, los ensayos descritos aquí servirán como plataforma para evaluar las células endoteliales periventriculares “enfermas” y las interneuronas generadas a partir de iPSC s de trastornos cerebrales como la esquizofrenia, el autismo o la epilepsia. Estos ensayos también se pueden utilizar para determinar cómo diferentes condiciones (por ejemplo, inhibidores, ligandos, ARN) afectan la migración celular. Por último, estos ensayos se pueden optimizar para otros tipos de células para medir la migración a larga distancia, la quimioatracción o la migración mediada por células celulares.

Protocol

1. Cultivo y almacenamiento de células endoteliales periventriculares humanas Mantener las células endoteliales periventriculares humanas en la matriz de membrana del sótano recubiertas (ver Tabla de Materiales) placas de 6 pocillos en medio de células endoteliales periventriculares (medio E6 que contiene 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/ml FGF2 y 5 oM GABA) a 37 oC y 5% deCO2. Cambie el medio cada día alterno. Descongelar la matriz de membrana del sótano en 4oC y hacer una so…

Representative Results

Los pasos para configurar una plaquita de cultivo de un solo pozo dentro de un plato de 35 mm se muestran en la Figura 1. El ensayo de migración de larga distancia y el ensayo de migración de cocultivo utilizaron un inserto de un solo pozo para sembrar el número deseado de células en el centro de un plato de 35 mm recubierto de poli-L-ornitina/laminina. En el día 0, las celdas estaban presentes como un parche rectangular(Figura 2</st…

Discussion

Aquí, describimos tres ensayos in vitro que juntos proporcionan una evaluación cuantitativa de las propiedades específicas de las células endoteliales periventriculares humanas. Estos ensayos serán valiosos para obtener información mecanicista sobre la interacción de las células endoteliales periventriculares humanas con las interneuronas humanas. Los experimentos con ligandos, inhibidores o células con derribo o sobreexpresión específicos de genes identificarán o validarán jugadores moleculares que median l…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por premios del Instituto Nacional de Salud Mental (R01MH110438) y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (R01NS100808) a AV.

Materials

Accutase dissociation solution Millipore Sigma SCR005 Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody Biolegend 802001
Anti-human CD31 antibody Millipore Sigma CBL468
Anti- MAP2 antibody Neuromics CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody Millipore Sigma AB3623
Control human endothelial cells Cellular Dynamics R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement Cellular Dynamics M1019
Cryogenic vials Fisher Scientific 03-337-7Y
DMEMF/12 medium Thermofisher Scientific 11320033
DMSO Sigma-Aldrich D2650
E6 medium Thermofisher Scientific A1516401
FGF2 Thermofisher Scientific PHG0261
Fibronectin Thermofisher Scientific 33016-015
Freezing Container Thermofisher Scientific 5100
GABA Sigma-Aldrich A2129
Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629
Human GABAergic neurons Cellular Dynamics R1013
Human GABAergic neurons base medium Cellular Dynamics M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement Cellular Dynamics M1032
Laminin Sigma L2020
Matrigel Corning 356230 Basement membrane matrix
Mounting Medium Vector laboratories H-1200
poly-L-ornithin Sigma p4957
PBS Thermofisher Scientific 14190
Trypan blue Thermofisher Scientific 15250061
TrypLE Thermofisher Scientific 12563011 Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A Peprotech 100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit Lifeline Cell Technologies LL-0003 Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert ibidi 80209
3-well silicone culture-Insert ibidi 80369
35 mm dish Corning 430165
15-ml conical tube Fisher Scientific 07-200-886
4% PFA solution Fisher Scientific AAJ19943K2
6-well tissue culture plate Fisher Scientific 14-832-11
Inverted phase contrast microscope Zeiss Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope Olympus FSX-100

Referências

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Citar este artigo
Datta, D., Vasudevan, A. Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons. J. Vis. Exp. (155), e60295, doi:10.3791/60295 (2020).

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