Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Endothelzellen bilden die Auskleidung der Blutgefäße und vermitteln wichtige Funktionen, die die Aufrechterhaltung der Durchlässigkeit der Gefäßwand, die Regulierung des Blutflusses, die Thrombozytenaggregation und die Bildung neuer Blutgefäße umfassen. Im Gehirn sind Endothelzellen Teil einer kritischen Blut-Hirn-Schranke, die den Materialaustausch zwischen dem Gehirn und dem Blutkreislauf streng steuert¹. Unsere Studien in den letzten zehn Jahren haben neue neurogene Rollen von Gehirn endothel Zellen identifiziert, die signifikante Auswirkungen auf die Entwicklung des Gehirns und Verhalten^{haben 2,3,4,5}. Wir haben gezeigt, dass das embryonale Vorderhirn der Maus durch zwei verschiedene Subtypen von Gefäßen, die pialen Gefäße und die periventrikulären Gefäße, die sich in Anatomie, Herkunft und Entwicklungsprofil^{unterscheiden,}vaskularisiert wird 2 . Endothelzellen, die diese beiden Gefäßsubtypen aussäumen, weisen deutliche Unterschiede in ihren Genexpressionsprofilen auf. Während piale Endothelzellen meist Gene exprimieren, die mit Entzündungen und Immunantwort zusammenhängen, sind periventrikuläre Endothelzellen einzigartig angereichert in der Expression von Genen, die häufig mit Neurogenese, neuronaler Migration, Chemotaxis und Axonführung assoziiert sind³. Periventrikuläre Endothelzellen beherbergen auch einen neuartigen GABA-Signalweg, der sich vom traditionellen neuronalen GABA-Signalweg⁵unterscheidet. Gleichzeitig mit seiner Genexpression, periventrikuläre Endothelzellen wurden gefunden, um Migration und Verteilung von GABAergen Interneuronen in der sich entwickelnden Neocortex zu regulieren. Während der embryonalen Entwicklung durchlaufen periventrikuläre Endothelzellen eine Fernmigration entlang eines ventral-dorsalen Gradienten, um das periventrikuläre Gefäßnetz^2,3zu etablieren. Diese Migrationsroute wird einen Tag später von Interneuren gespiegelt. Migrierende Interneuroner interagieren physisch mit dem vorgebildeten periventrikulären Gefäßnetz und nutzen es als Leitlinie, um ihr endgültiges Ziel im Neocortex zu erreichen. Periventrikuläre Endothelzellen dienen nicht nur als physikalisches Substrat, sondern dienen auch als Quelle für Navigationshinweise für die Migration von Neuronen. Periventrikuläre endotheliale Zellsekretierte GABA leitet interneuron Migration und reguliert ihre endgültigen Verteilungsmuster⁴. Defekte in interneuron Migration und Verteilung sind mit neuropsychiatrischen Störungen wie Autismus, Epilepsie, Schizophrenie und Depression^6,7,8,9,10verbunden. Daher wird die Untersuchung der periventrikulären Endothelzellfunktionen und ihres Einflusses auf die interneuronische Migration im menschlichen Kontext entscheidend für die Bekämpfung der Pathogenese dieser Störungen.

Wir haben menschliche periventrikuläre Endothelzellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen in unserem Labor¹¹mit induzierter pluripotenter Stammzelltechnologie (iPSC)^12,13erzeugt. Um zu validieren, ob menschliche periventrikuläre Endothelzellen die periventrikulären Endothelzellen der Maus originalgetreu imitieren und ihren Einfluss auf die interneuronische Migration quantitativ bewerten können, entwickelten wir drei In-vitro-Assays: einen Fernmigrationstest, einen Co-Kultur-Migrationstest und einen Chemo-Attraktions-Assay. Hier beschreiben wir Protokolle für diese Assays im Detail. Alle drei Assays basieren auf der Verwendung von Silikonkultureinsätzen, um einen kleinen rechteckigen Zellfleck (mit festen Abmessungen) zu erstellen, der von zellfreiem Raum umgeben ist. Der Migrationsabstand wird ausgewertet, indem der Abstand zwischen den endlaufenden Positionen von Zellen vom Rand des rechteckigen Patches gemessen wird, der am Tag 0 umrissen wurde. Im Fernwanderungstest werden menschliche periventrikuläre Endothelzellen als Pflaster in der Mitte einer 35-mm-Schale ausgesät, und die von den Zellen über einen langen Zeitraum zurückgelegten Entfernungen werden berechnet. Im Co-Kultur-Migrationstest werden menschliche periventrikuläre Endothelzellen mit menschlichen Interneuronen als ein Pflaster in einer 35-mm-Schale mitgesät. Diese Einrichtung ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen direkter physischer Wechselwirkungen dieser beiden Zelltypen auf die Migrationsrate von Interneuronen. Der Chemo-Attraktionstest misst die Migration von Interneuronen als Reaktion auf chemoattraktive Hinweise, die von menschlichen periventrikulären Endothelzellen sezerniert werden. Interneuronen werden als rechteckiges Pflaster mit menschlichen periventrikulären Endothelzellen gesät und kontrollieren nicht-periventrikuläre Endothelzellen, die als ähnlich große Pflaster auf beiden Seiten gesät werden. Jede der Zellpflaster wird durch einen zellfreien Spalt von 500 m getrennt. Die Reaktion von Interneuronen wird durch Quantifizierung der Anzahl der Zellen, die zu periventrikulären endothelialen Zellen gewandert sind, im Vergleich zur Kontrolle nicht-periventrikulärer endotheliale Zellen bewertet.

Diese Assays liefern eine robuste Bewertung der funktionen der humanen periventrikulären Endothelzellen und ihres Einflusses auf die interneuronische Migration. Die neuartige Einrichtung des Fernassays und des Co-Kultur-Migrations-Assays bietet zellfreien Raum im Bereich von Zentimetern (1-1,5 cm), um die Erkennung von Fernmigration zu ermöglichen. Eine Zusammenfassung der Merkmale unserer Assays im Vergleich zu anderen populären Assays ist in Tabelle 1dargestellt. Gemeinsam werden die hier beschriebenen Assays als Plattform für die Bewertung “kranker” periventrikulärer Endothelzellen und Interneuronen dienen, die aus iPSCs von Hirnerkrankungen wie Schizophrenie, Autismus oder Epilepsie erzeugt werden. Diese Assays können auch verwendet werden, um zu bestimmen, wie unterschiedliche Bedingungen (z. B. Inhibitoren, Liganden, RNAi) die Zellmigration beeinflussen. Schließlich können diese Assays für andere Zelltypen optimiert werden, um die Migration über die Ferne, die Chemo-Attraktion oder die zellzellvermittelte Migration zu messen.