Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

Endotheelcellen vormen het slijmvlies van bloedvaten en bemiddelen belangrijke functies zoals het onderhoud van de doorlaatbaarheid van de vaatwand, regulering van de bloedstroom, bloedplaatjesaggregatie en vorming van nieuwe bloedvaten. In de hersenen maken endotheelcellen deel uit van een kritische bloed-hersenbarrière die de uitwisseling van materialen tussen de hersenen en de bloedbaan strak controleert¹. Onze studies in het afgelopen decennium hebben nieuwe neurogene rollen van hersenendotheliale cellen geïdentificeerd die aanzienlijke implicaties hebben voor de ontwikkeling van de hersenen en gedrag^2,3,4,5. We hebben aangetoond dat de embryonale voorhersenen van de muis gevasculariseerd is door twee verschillende subtypen vaten, de pialvaten en de periventrculaire vaten, die verschillen in anatomie, oorsprong en ontwikkelingsprofiel². Endotheelcellen langs deze twee soorten vaartuigen vertonen duidelijke verschillen in hun genexpressieprofielen. Terwijl piale endotheelcellen meestal genen met betrekking tot ontsteking en immuunrespons uitdrukken, zijn periventrtriculaire endotheelcellen uniek verrijkt in expressie van genen die vaak geassocieerd worden met neurogenese, neuronale migratie, chemotaxis en axonbegeleiding³. Periventricular endotheliale cellen ook huis een nieuwe GABA signalering pad dat is onderscheiden van de traditionele neuronale GABA signalering pad⁵. Gelijktijdig met zijn genexpressie bleken periventrtriculaire endotheelcellen de migratie en distributie van GABAergic interneuronen in de zich ontwikkelende neocortex te reguleren. Tijdens de embryonale ontwikkeling ondergaan periventricular endotheliale cellen langdurige migratie langs een ventrale ruggradiënt om het periventrtriculaire vasculaire netwerk vast te stellen^2,3. Deze migratieroute wordt een dag later gespiegeld door interneuronen. Migrerende interneuronen interageren fysiek met het vooraf gevormde periventrtriculaire vasculaire netwerk en gebruiken het als een geleiderail om hun eindbestemming in de neocortex te bereiken. Naast het fungeren als een fysiek substraat, periventricular endotheliale cellen dienen als de bron van navigatie signalen voor migrerende neuronen. Periventricular endotheliale cel-uitgescheiden GABA gidsen interneuron migratie en reguleert hun uiteindelijke distributie patronen⁴. Defecten in interneuron migratie en distributie worden geassocieerd met neuropsychiatrische stoornissen zoals autisme, epilepsie, schizofrenie en depressie^6,7,8,9,10. Daarom wordt studie van periventricular endotheliale celfuncties en hun invloed op interneuronmigratie in menselijke context van cruciaal belang voor het aanpakken van de pathogenese van deze aandoeningen.

We hebben menselijke periventrtriculaire-achtige endotheelcellen gegenereerd uit menselijke embryonale stamcellen in ons laboratorium¹¹, met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologie^12,13. Om te valideren of menselijke periventricular endotheelcellen getrouw muisperiventricular endotheliale cellen nabootsen, en om hun invloed op interneuronmigratie kwantitatief te beoordelen, ontwikkelden we drie in vitro tests: een lange afstandsmigratietest, een co-cultuurmigratietest en een chemo-aantrekkelijkheidstest. Hier beschrijven we protocollen voor deze testen in detail. Alle drie de tests zijn gebaseerd op het gebruik van siliconen cultuur inserts om een kleine rechthoekige patch van cellen (van vaste afmetingen) omgeven door celvrije ruimte te creëren. Migratieafstand wordt geëvalueerd door de afstand tussen de eindposities van cellen te meten vanaf de rand van de rechthoekige patch die op dag 0 is beschreven. In de lange afstand migratie test, menselijke periventricular endotheliale cellen worden gezaaid als een patch in het midden van een 35 mm schotel, en de afstanden afgelegd door de cellen over een lange reeks van tijd worden berekend. In de co-cultuur migratie test, menselijke periventricular endotheliale cellen zijn co-gezaaid met menselijke interneuronen als een patch in een 35 mm schotel. Deze opstelling maakt het mogelijk om het effect van directe fysieke interacties van deze twee celtypen op de mate van migratie van interneuronen te onderzoeken. De chemo-attractie test meet de migratie van interneuronen in reactie op chemo-aantrekkelijke signalen afgescheiden door menselijke periventricular endotheliale cellen. Interneuronen worden gezaaid als een rechthoekige patch, met menselijke periventrtriculaire endotheelcellen en controle niet-perivefntricular endotheliale cellen gezaaid als vergelijkbare grootte patches aan weerszijden. Elk van de celpleisters wordt gescheiden door een celvrije kloof van 500 μm. De respons van interneuronen wordt beoordeeld door het aantal cellen te kwantificeren dat naar periventricular endotheliale cellen is gemigreerd in vergelijking met de controle van niet-periventrtriculaire endotheelcellen.

Deze tests bieden een robuuste beoordeling van menselijke periventricular endotheliale celfuncties en hun invloed op interneuron migratie. De nieuwe opzet van lange afstand test en co-cultuur migratie test biedt cel-vrije ruimte in het bereik van centimeters (~ 1-1,5 cm) om detectie van lange afstand migratie mogelijk te maken. Een samenvatting van de kenmerken van onze tests in vergelijking met andere populaire tests wordt gepresenteerd in tabel 1. Gezamenlijk, de testen hier beschreven zal dienen als een platform voor de beoordeling van “zieke” periventricular endotheliale cellen en interneuronen gegenereerd uit iPSCs van hersenaandoeningen zoals schizofrenie, autisme of epilepsie. Deze tests kunnen ook worden gebruikt om te bepalen hoe verschillende aandoeningen (bijvoorbeeld remmers, liganden, RNAi) de celmigratie beïnvloeden. Ten slotte kunnen deze tests worden geoptimaliseerd voor andere celtypen om migratie over lange afstand, chemo-aantrekkingskracht of celcelgemedieerde migratie te meten.