Summary

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Published: July 20, 2019
doi:

Summary

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Abstract

Mitokondri ve endoplazmik retikulum (er) gibi hücresel organeller, çeşitli fonksiyonları gerçekleştirmek için bir ağ oluşturur. Bu son derece kavisli yapılar, hücresel koşullara bağlı olarak dinamik bir ağ oluşturmak için çeşitli şekillerde katlanmış. Mitokondri ve ER arasında bu ağın görselleştirme süper çözünürlüklü floresan görüntüleme ve ışık mikroskobu kullanılarak denenmiştir; Ancak, sınırlı çözünürlük mitokondri ve ER arasındaki membranları ayrıntılı olarak gözlemlemek için yeterli değildir. Şanzıman Elektron Mikroskopisi, hücresel organizerin gözlem için iyi membran kontrast ve nanometre ölçekli çözünürlük sağlar; Ancak, son derece eğri organelleri üç boyutlu (3B) yapısını değerlendirirken son derece zaman alıcı. Bu nedenle, mitokondri ve er ‘in bağıntılı ışık-elektron mikroskobu (Clem) ve hacim elektron mikroskopi teknikleri ile gelişmiş askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama kullanılarak morfolojisini gözlemledik. 3B yapıyı gözlemlemek için en blok boyama yöntemi, ultra ince seri sekleme (dizi tomografi) ve hacim elektron mikroskobu uygulandı. Bu protokolde, mitokondri ve ER ‘in ayrıntılı yapısal çalışmalarını gerçekleştirmek için CLEM ve 3D elektron mikroskobu kombinasyonunu öneriyoruz.

Introduction

Mitokondri ve endoplazmik retikulum (er) membran bağlı hücresel organellerdir. Onların bağlantı fonksiyonları için gerekli olan ve proteinleri ağ ile ilgili1tanımlanmıştır. Mitokondri ve ER arasındaki mesafe yaklaşık 100 Nm ışık mikroskobu kullanarak bildirilmiştir2; Ancak, son süper çözünürlüklü microskopi3 ve elektron mikroskobu (EM)4 çalışmalar yaklaşık 10-25 Nm, önemli ölçüde daha küçük olduğunu ortaya koydu. Süper çözünürlüklü mikroskopide elde edilen çözünürlük EM ‘den daha düşüktür ve özel etiketleme gereklidir. EM, mitokondri ve ER arasındaki bağlantıların yapısal çalışmaları için yeterince yüksek çözünürlüklü kontrast elde etmek için uygun bir tekniktir. Ancak, ince bölümler geleneksel iletim elektron mikroskobu (TEM) için yaklaşık 60 Nm veya daha ince olması gerektiğinden, sınırlı z ekseni bilgileri dezavantajı. Yeterli EM z ekseni görüntüleme için üç boyutlu elektron mikroskobu (3DEM)5kullanılabilir. Ancak, bu tüm hücrelerin ince seri bölümlerin yüzlerce hazırlanması içerir, bu çok zor bir iştir sadece birkaç yetenekli teknolojistler hakim var. Bu ince bölümler, kırılgan formvar film kaplı tek delikli TEM ızgaraları üzerinde toplanır. Film bir gird üzerinde kırarsa, seri görüntüleme ve hacim yeniden yapılanma mümkün değildir. Seri blok-yüz tarama elektron mikroskobu (SBEM) bir elmas bıçak (dik-SBEM) ya da bir odaklı iyon ışın (FıB-SEM) ile Tarama elektron mikroskop (SEM) vakum odası içinde yıkıcı en bloğun bölünmesi kullanan 3DEM için popüler bir tekniktir 6. ancak, bu teknikler tüm tesislerinde mevcut olmadığından, biz dizi tomografi7 seri kesme ve SEM kullanarak öneririz. Dizi tomografi, bir ultralotome kullanılarak kesilmiş seri bölümler bir Tem ızgara yerine bir cam lamel magazini aktarılır ve ışık mikroskobu ve SEM8aracılığıyla görselleştirildi. Backscatter Electron (BSE) görüntülemenin sinyalini geliştirmek için, osmiofilik thiocarbohidazid (TCH)9ile sabit hücreler olan bir en bloklu em boyama protokolüne (OSO4) Çift boyama sonrası katıştırma.

Ayrıca, mitokondriyal Marker SCO1 (sitokrom c oksidaz montaj protein 1) – askorbat peroksidaz 2 (APEX2)10 moleküler etiket em düzeyinde mitokondri görselleştirmek için kullanıldı. APEX2 yaklaşık 28 kDa ve soya askorbat peroksitase11türetilmiştir. Özel proteinlerin EM seviyesinde ayrıntılı yerini, yeşil floresan protein etiketli proteinin ışık mikroskobu içinde kullanıldığı şekilde göstermek için geliştirilmiştir. APEX2, kofaktör hidrojen peroksit (H2O2) varlığında etiketin yerinde çözünebilir bir osmiophic polimer içine 3, 3 ‘-diaminobenzidine (DAB) dönüştürür. APEX2, tüm hücrenin derinliği boyunca bir protein lokalizasyonu ile EM ‘de geleneksel antikor etiketleme alternatifi olarak kullanılabilir. Başka bir deyişle, APEX2-etiketlenmiş protein, Ultra-kriyobölümlemeden sonra immünogeski etiketleme ve geçirgen olmadan spesifik osmikasyon11 ile görselleştirilebilir. Horserpu peroksidaz (HRP) Ayrıca, OsO4ile tedavi EDILDIKTEN sonra em kontrast sağlayan, lokalize bir çökelme Içine DAB H2O2bağımlı polimerizasyonu katalizleyen hassas bir etikettir. ER hedef peptid serisi HRP-KDEL (LYS-ASP-Glu-Leu)12 tüm hücre içinde er görselleştirmek için uygulandı. Genetik etiketlerin kullanılması ve en az osmiyum ve TCH (rOTO yöntemi) ile aynı anda osmikasyon etkisini kullanarak blok boyama ile ilgili protokollerimizi değerlendirmek için, membranı kontrast ile ve rOTO en bloğunda her genetik etiketin kullanmadan karşılaştırdık. Dizi tomografi ve DAB boyama ile APEX ve HRP ile 3DEM, sırasıyla, diğer amaçlar için kullanılmıştır, çünkü biz 3DEM için dizi tomografi ve mitokondri ve ER etiketleme için DAB boyama kombine var bizim protokol benzersizdir. Özellikle, biz hücrelerde genetik modifikasyon etkisini araştırırken destekli aynı bölümde APEX Tagged genleri ile ve olmadan beş hücre gösterdi.

Protocol

1. SCO1-APEX2 ve HRP-KDEL Plasmid vektör ile desenli ızgara kültürü çanak ve hücre transfeksiyon ile hücre kültürü Tohum 1 x 105 HEK293T hücreleri, 35-mm cam ızgara-altta kültür yemekleri içine yerleştirerek% 5 Co2 ‘ de 37 °c ‘ de bulunan bir nemlendirici atmosferde, Dulbecco ‘nun modifiye kartal Orta (dmem) ile% 10 fetal Sığır serum, 100 U/ml ile tamamlayıcı Penisilin ve 100 U/mL streptomisin. Hücrelerin tohumlama sonrası gün, onlar% 50-60% konfluency y…

Representative Results

Şekil 1 , bu protokol için zamanlama ve iş akışını açıklar. Protokol 7 gün gerektirir; Ancak, SEM görüntüleme için harcanan zamana bağlı olarak, bu artabilir. Hücre transfeksiyon için, hücrelerin konflukans tüm ızgara plaka alt kapak değil olarak kontrol edilmelidir (Şekil 1a). Yüksek hücreli yoğunluk, ışık mikroskobu ve EM gözlem sırasında ilgi hücresinin tanımlanmasını engelleyebilir. Biz APEX2 ve HRP verimli kültür çanak sayısız kültürlü hü…

Discussion

EM kullanarak bir nanometre çözünürlükte belirli proteinlerin hücresel lokalizasyonu belirlenmesi proteinlerin hücresel işlevlerini anlamak için çok önemlidir. Genellikle, EM aracılığıyla bir hedef protein lokalizasyonu incelemek için iki teknikleri vardır. Bir immünogold tekniği, hangi EM 1960 beri kullanılan ve diğer bir teknik son zamanlarda geliştirilen genetik kodlu Etiketler16kullanarak olduğunu. Geleneksel immünogold teknikleri, etiketli protein yerini göstermek iç…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma tarafından desteklenmektedir KBRI temel araştırma programı Kore beyin Araştırma Enstitüsü Bakanlığı Bilim ve BIT tarafından finanse (19-BR-01-08), ve Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) Grant Kore hükümeti tarafından finanse (MSIT) (No. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 ve HRP-KDEL plazmids, Hyun-Woo Rhee (Seul Ulusal Üniversitesi) tarafından temin edildi. TEM verileri KBRı ‘deki Brain Research Core tesisleri ‘nde elde edildi.

Materials

Glutaraldehyde EMS 16200 Use only in fume hood
Paraformaldehyde EMS 19210 Use only in fume hood
Sodium cacodylate EMS 12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution EMS 16320 Use only in fume hood
Epon 812 EMS 14120 EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 – 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D Leica ARTOS 3D
Uranyl acetate EMS 22400 Hazardous chemical
Lead citrate EMS 17900
35mm Gridded coverslip dish Mattek P35G-1.5-14-CGRD
Glow discharger Pelco easiGlow
Formvar carbon coated Copper Grid Ted Pella 01805-F
Hydrochloric acid SIGMA 258148
Fugene HD Promega E2311
Glycine SIGMA G8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) SIGMA D8001 Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solution Merck 107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate SIGMA P3289
0.22 um syringe filter Sartorius 16534
Thiocarbonyldihydrazide SIGMA 223220 Use only in fume hood
Potassium hydroxide Fluka 10193426
L-aspartic acid SIGMA A9256
Ethanol Merck 100983
Transmission electron microscopy FEI Tecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips SPI 06489-AB fragil glass
Isopropanol Fisher Bioreagents BP2618-1
Diamond knife Leica AT-4
Inveted light microscopy Nikon ECLipse TS100
Scanning electron microscopy Zeiss Auriga

Referências

  1. Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
  2. Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).
  3. Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  4. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
  5. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
  6. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  7. Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
  8. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  9. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid–containing membranes and droplets in osmium tetroxide–fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  10. Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
  11. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  12. Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).
  15. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  16. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
  17. Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
  18. Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
  19. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923 (2015).
  20. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
  21. Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).
  22. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
  23. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  24. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).

Play Video

Citar este artigo
Jung, M., Mun, J. Y. Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (149), e59750, doi:10.3791/59750 (2019).

View Video