Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Mitochondriën en endoplasmisch reticulum (ER) zijn membranen gebonden cellulaire organellen. Hun verbinding is noodzakelijk voor hun functie, en eiwitten met betrekking tot hun netwerk zijn beschreven¹. De afstand tussen de mitochondriën en ER is gerapporteerd als ongeveer 100 nm met behulp van Lichtmicroscopie²; echter, recente super-resolution microscopie³ en elektronenmicroscopie (em)⁴ studies hebben aangetoond dat het aanzienlijk kleiner, bij ongeveer 10-25 nm. De resolutie die is bereikt in superresolutie microscopie is lager dan EM, en specifieke labeling is noodzakelijk. EM is een geschikte techniek om een voldoende hoge-resolutie contrast te bereiken voor structurele studies van de verbindingen tussen mitochondriën en ER. Een nadeel is echter de beperkte z-as-informatie, omdat de dunne delen ongeveer 60 Nm of dunner moeten zijn voor conventionele transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Voor voldoende EM-z-asbeeldvorming kan drie-dimensionale elektronenmicroscopie (3DEM) worden gebruikt⁵. Dit impliceert echter de voorbereiding van honderden dunne seriële secties van hele cellen, wat erg lastig werk is dat slechts een paar bekwame technologen onder de knie hebben. Deze dunne delen worden verzameld op fragiele formvar filmomhulde One-hole TEM roosters. Als de film breekt op één gird, is seriële beeldvorming en volume reconstructie niet mogelijk. Serie Block-face scanning electron microscopie (sbem) is een populaire techniek voor 3dem die gebruik maakt van destructief en bloc snijden in de Scanning Electron Microscoop (SEM) vacuümkamer met ofwel een diamantmes (dik-sbem) of een gerichte ionen straal (FIB-SEM) ⁶. omdat deze technieken echter niet beschikbaar zijn op alle faciliteiten, raden we array computertomografie⁷ aan met behulp van Serial snij en SEM. In array tomografie worden seriële secties die met behulp van een ultramicrotome worden afgesneden, overgebracht naar een glazen afdekplaat in plaats van een TEM-raster en gevisualiseerd via Lichtmicroscopie en SEM⁸. Om het signaal voorbeeld vorming met Backscatter Electron (BSE) te verbeteren, gebruikten we een en bloc EM-kleurings protocol met osmium tetroxide (OsO₄)-vaste cellen met osmiofiele thiocarbohydrazide (tch)⁹, waardoor we beelden kunnen verkrijgen zonder dubbele kleuring na inbedding.

Bovendien, de mitochondriale marker SCO1 (cytochroom c oxidase assembly eiwit 1) – ascorbaat peroxidase 2 (APEX2)¹⁰ moleculaire tag werd gebruikt om te visualiseren van mitochondriën op het em-niveau. APEX2 is ongeveer 28 kDa en is afgeleid van soja ascorbaat peroxidase¹¹. Het werd ontwikkeld om de gedetailleerde locatie van specifieke eiwitten op het EM-niveau te tonen, op dezelfde manier dat groen fluorescerend eiwit-gelabeld eiwit wordt gebruikt in lichte microscopie. APEX2 zet 3, 3 ‘-diaminobenzidine (DAB) om in een onoplosbaar osmiofiele polymeer op de plaats van de tag in aanwezigheid van de cofactor waterstofperoxide (H₂O₂). APEX2 kan worden gebruikt als alternatief voor traditionele antilichaam etikettering in EM, met een eiwit lokalisatie door de gehele diepte van de hele cel. Met andere woorden, het APEX2-Tagged eiwit kan worden gevisualiseerd door specifieke osmication¹¹ zonder immunogold labeling en permeabilization na Ultra-cryosnijden. Mierikswortelperoxidase (HRP) is ook een gevoelige tag die de H₂O₂-afhankelijke polymerisatie van DAB in een gelokaliseerd precipitaat KATALYSEERT, waardoor em-contrast wordt gegeven na behandeling met OsO₄. De ER-doel peptide sequentie HRP-KDEL (Lys-ASP-glu-Leu)¹² werd toegepast om er binnen een hele cel te visualiseren. Om ons protocol te evalueren van het gebruik van genetische Tags en en bloc-kleuring met gereduceerde osmium en TCH (rOTO-methode), met behulp van het osmication-effect op hetzelfde moment, vergeleken we het membraan contrast met en zonder het gebruik van elk genetisch label in rOTO en bloc-kleuring. Hoewel 3dem met array computertomografie en DAB-kleuring met Apex en HRP respectievelijk zijn gebruikt voor andere doeleinden, is ons protocol uniek omdat we array computertomografie hebben gecombineerd voor 3dem en DAB-kleuring voor mitochondriën en er-labeling. Concreet toonden we vijf cellen met en zonder APEX-Tagged genen in dezelfde sectie, die hielp bij het onderzoeken van het effect van de genetische modificatie op cellen.