미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징
Summary
우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.
Abstract
미토콘드리아 및 기관망망(ER)과 같은 세포 소기관은 다양한 기능을 수행하는 네트워크를 만듭니다. 이러한 고곡선 구조는 셀룰러 조건에 따라 동적 네트워크를 형성하기 위해 다양한 모양으로 접혀 있습니다. 미토콘드리아와 ER 사이 이 네트워크의 가시화는 초고해상도 형광 화상 진찰 및 광 현미경 검사법을 사용하여 시도되었습니다; 그러나, 제한된 해결책은 미토콘드리아와 ER 사이 막을 상세히 관찰하기에 불충분하다. 전송 전자 현미경 검사법은 세포 소기관의 관찰을 위한 좋은 막 대조 및 나노미터 규모 해결책을 제공합니다; 그러나 고곡선 소기관의 3차원(3D) 구조를 평가할 때 는 매우 시간이 많이 걸립니다. 따라서, 우리는 강화된 아스코르브베이트 과산화공2 및 고추냉이 과옥시다아제 염색을 사용하여 상관경연산빛전자현미경법(CLEM) 및 부피 전자현미경기술을 통해 미토콘드리아와 ER의 형태를 관찰하였다. 3D 구조를 관찰하기 위해 엔블록 염색 방법, 초박형 직렬 단면화(배열 단층 촬영) 및 부피 전자 현미경을 적용하였다. 이 프로토콜에서는, 우리는 미토콘드리아와 ER의 상세한 구조적인 연구를 능력을 발휘하기 위하여 CLEM와 3D 전자 현미경 검사법의 조합을 건의합니다.
Introduction
미토콘드리아및기관망망소(ER)는 막결합 세포소기관입니다. 그들의 연결은 그들의 기능에 필요하고, 그들의 네트워크와관련있는 단백질은 1을 기술되었습니다. 미토콘드리아와 ER 사이의 거리는 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 약 100 nm로 보고되었습니다2; 그러나, 최근 초고해상도 현미경 검사법3 및 전자 현미경 검사법 (EM)4 연구 결과는 대략 10-25 nm에서 상당히 더 작은 것으로 나타났습니다. 초고해상도 현미경 검사법에서 달성된 분해능은 EM보다 낮으며 특정 라벨링이 필요합니다. EM은 미토콘드리아와 ER 사이의 연결에 대한 구조적 연구를 위해 충분히 고분해능 대비를 달성하기에 적합한 기술이다. 그러나, 종래의 투과 전자현미경(TEM)의 경우 얇은 단면이 약 60 nm 또는 더 얇아야 하기 때문에 제한된 z축 정보가 제한된 단점이다. 충분한 EM z 축 화상 진찰을 위해, 3차원 전자 현미경검사법 (3DEM)는 5를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 단지 몇몇 숙련된 기술자가 마스터한 아주 까다로운 일인 전체 세포의 얇은 직렬 단면도의 수백의 준비를 관련시킵니다. 이러한 얇은 섹션은 깨지기 쉬운 formvar 필름 코팅 한 홀 TEM 그리드에 수집됩니다. 필름이 하나의 거드에서 파손되면 직렬 이미징 및 볼륨 재구성이 불가능합니다. 직렬 블록-얼굴 주사 전자 현미경 검사법 (SBEM)은 다이아몬드 나이프 (Dik-SBEM) 또는 초점 이온 빔 (FIB-SEM) 중 하나와 주사 전자 현미경 (SEM) 진공 챔버 내부 파괴적인 enbloc 절편을 사용하는 3DEM에 대한 인기있는 기술입니다 6. 그러나 이러한 기술은 모든 시설에서 사용할 수 없기 때문에 직렬 단면 및 SEM을 사용하여 배열 단층 촬영 7을 권장합니다. 어레이 단층 촬영에서, 울트라 마이크로 톰을 사용하여 절단 된 직렬 섹션은 TEM 그리드 대신 유리커버 슬립으로 전송되고 빛 현미경 검사법 및 SEM 8을 통해 시각화됩니다. 백스캐터 전자(BSE) 이미징신호를 향상시키기 위해 오스뮴 테트옥사이드(OsO 4)-오스미오필릭티오카르보하이드라지드(TCH) 9를 사용하는 고정형 세포를활용한 엔블록 EM 염색 프로토콜을 활용하여, 없이 이미지를 얻을 수 있게 되었습니다. 포스트 임베딩 이중 염색.
부가적으로, 미토콘드리아 마커 SCO1(시토크롬 c 산화다아제 어셈블리 단백질 1)-아스코르브베이트 과산화아제 2(APEX2)10 분자 태그를 EM 수준에서 미토콘드리아를 가시화하는 데 사용되었다. APEX2는 약 28 kDa이며 대두 아스코르브베이트 과산화수지11에서 유래된다. 녹색 형광 단백질 태그 단백질이 가벼운 현미경 검사법에서 사용되는 것과 같은 방식으로 EM 수준에서 특정 단백질의 상세한 위치를 보여주기 위해 개발되었습니다. APEX2는 3,3′ -다미노벤지딘(DAB)을 공동인자 과산화수소(H2O2)의 존재 시 태그 부위에 불용성OSMiophilic 폴리머로 변환합니다. APEX2는 EM에서 전통적인 항체 라벨링의 대안으로 사용될 수 있으며, 전체 세포의 깊이에 걸쳐 단백질 국소화를 할 수 있다. 즉, APEX2 태그가 부착된 단백질은 초저온 절제 후 면역골 표지 및 투과없이 특이적 삼투압(11)에 의해 가시화될 수 있다. 고추냉이 과산화 효소(HRP)는 또한 H2O2-의존적DAB를 국부화된 침전물 내로 촉매시키는 민감한 태그이며, OsO4로처리한 후 EM 대비를 제공한다. ER 표적 펩티드 서열 HRP-KDEL(lys-asp-glu-leu)(12)을 전체 세포 내에서 ER을 시각화하기 위해 적용하였다. 감소된 오스뮴 및 TCH(rOTO 방법)로 유전적 태그 및 enbloc 염색을 활용하는 우리의 프로토콜을 평가하기 위해, 동시에 삼투유 효과를 사용하여, 우리는 rOTO en bloc 염색에서 각 유전자 태그의 사용 없이 막 대비를 비교하였다. APEX 및 HRP를 가진 배열 단층 촬영 및 DAB 염색을 가진 3DEM이 각각, 그밖 목적을 위해 이용되었더라도, 우리가 미토콘드리아와 ER 라벨링을 위한 3DEM및 DAB 염색을 위한 배열 단층 촬영을 결합했기 때문에 우리의 프로토콜은 유일합니다. 특히, 우리는 세포에 대한 유전자 변형의 효과를 조사하는 데 도움이 같은 섹션에서 APEX 태그 유전자없이 다섯 세포를 보여 주었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
EM을 사용하여 나노미터 해상도에서 특정 단백질의 세포 국소화를 결정하는 것은 단백질의 세포 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 일반적으로 EM을 통해 표적 단백질의 국소화를 연구하는 두 가지 기술이 있다. 하나는 1960년부터 EM에서 사용되어 온 면역골 기술이며, 다른 하나는 최근에 개발된 유전자 부호타호16을사용하는 기술이다. 전통적인 면역금 기술은 표지된 단백질?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 한국과학기술정보통신부(19-BR-01-08)의 지원을 받는 한국뇌연구원과 한국정부(MSIT)의 후원을 받은 한국뇌연구원(NRF)을 통해 지원되었다. 2019R1A2C10634). SCO1-APEX2와 HRP-KDEL 플라스미드는 이현우(서울대학교)가 친절하게 제공했다. TEM 데이터는 KBRI의 뇌 연구 핵심 시설에서 수집되었습니다.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 – 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
Referências
- Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
- Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
- Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid–containing membranes and droplets in osmium tetroxide–fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
- Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
- Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923 (2015).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).
- Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
