Qui, presentiamo un protocollo di amputazione della falange terminale dei topi adulti per studiare la formazione di blastema mammifero e l’ossificazione intramembranosa, analizzata dall’immunohistochimica fluorescente e dalla tomografia microcalcolata in vivo sequenziale.
Qui, presentiamo un protocollo di amputazione terminale distale distale adulto (P3), un modello di mammifero procedurale semplice e riproducibile di rigenerazione epimorfica, che coinvolge la formazione di blastema e l’ossificazione intramembrana analizzata da immunohistochimica a fluorescenza e tomografia microcalcolata in vivo sequenziale (CT). La rigenerazione dei mammiferi è limitata alle amputazioni che trasmettono la regione distale della falange terminale (P3); le cifre amputate a livelli più prossimali non riescono a rigenerare e a subire la guarigione fibrotica e la formazione di cicatrici. La risposta di rigenerazione è mediata dalla formazione di un blastema proliferante, seguita dalla rigenerazione ossea tramite ossificazione intramembranosa per ripristinare la lunghezza scheletrica amputata. L’amputazione P3 è un modello preclinico per studiare la rigenerazione epimorfica nei mammiferi ed è un potente strumento per la progettazione di strategie terapeutiche per sostituire la guarigione fibrotica con una risposta rigenerativa di successo. Il nostro protocollo utilizza l’immunohistochimica a fluorescenza a 1) identificare le popolazioni di cellule di blastema precoce e tardiva, 2) studiare la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione, e 3) studiare l’ossificazione intramembranosa senza la necessità di ossa complesse dispositivi di stabilizzazione. Dimostriamo anche l’uso di immagini sequenziali in vivo per creare immagini ad alta risoluzione per esaminare i cambiamenti morfologici dopo l’amputazione, nonché quantificare i cambiamenti di volume e lunghezza nella stessa cifra nel corso della rigenerazione. Crediamo che questo protocollo offra un’enorme utilità per studiare le risposte epimorfiche e rigenerative dei tessuti nei mammiferi.
I mammiferi, compresi gli esseri umani e i topi, hanno la capacità di rigenerare le punte delle loro cifre dopo l’amputazione distale della falange terminale (P3)1,2,3. Nei topi, la risposta di rigenerazione è dipendente dal livello di amputazione; amputazioni a cifre sempre più prossimal mostrano una risposta rigenerativa progressivamente attenuata fino al completo fallimento rigenerativo alle amputazioni che trasmettono e proximal alla matrice di unghie P34,5,6 , 7 (in questo stato , 8. La rigenerazione P3 è mediata dalla formazione di un blastema, definito come una popolazione di cellule proliferanti che subiscono la morfogenesi per rigenerare le strutture amputate9. La formazione di un blastema per rigenerare le strutture perse dall’amputazione, un processo chiamato rigenerazione epimorfica, distingue la risposta di rigenerazione P3 multi-livello tissutale dalla riparazione tradizionale dei tessuti dopo la lesione6, 10.La rigenerazione P3 è un modello riproducibile e procedurale semplice per studiare complessi processi rigenerativi tra cui la guarigione delle ferite11,12, istolisi ossea11,12, vascellizzazione13, rigenerazione del nervo periferico14, e conversione blastemica in osso tramite ossificazione intramembranosa15.
Studi precedenti che utilizzano l’immunosintochimica hanno dimostrato che il blastema è eterogeneo, avascolare, ipossico e altamente proliferante11,13,15,16. A seguito dell’amputazione dissatsale del P3, il blastema primitivo è inizialmente associato al periosteo P3 e all’endosteo ed è caratterizzato da una robusta proliferazione e osteogenesi nascente adiacente alla superficie ossea15. Dopo la degradazione ossea e la chiusura della ferita, il blastema eterogeneo è formato dalla fusione di cellule associate al periosteal ed endosteal, seguito dalla differenziazione dei componenti blastemale, tra cui l’osso attraverso l’ossificazione intramembrana 15.
La riparazione ossea in risposta a lesioni avviene tipicamente per ossificazione endocondrale, cioè tramite un callo cartilagineo iniziale che forma un modello per la successiva formazione ossea17,18. L’ossificazione intramembranosa dell’osso lungo, cioè la formazione ossea senza un intermedio cartilagineo, è comunemente indotta utilizzando complessi dispositivi di distrazione o fissazione chirurgica19,20. La risposta alla rigenerazione numerica è un modello preclinico che offre vantaggi rispetto ai modelli convenzionali di osssificazione intramembranous: 1) non richiede lesioni post post di fissaggio esterne o interne per stimolare l’ossificazione intramembrana, 2) è l’analisi sequenziale in vivo della tomografia microcalcolata (CT) può essere eseguita con facilità e velocità utilizzando 4 cifre, massimizzando così i campioni riducendo al minimo l’uso di animali e l’analisi sequenziale della tomografia microcalcolata in vivo (CT) può essere eseguita con facilità e velocità.
Nel presente studio, mostriamo il piano standardizzato di amputazione P3 per ottenere una risposta di rigenerazione riproducibile e robusta. Inoltre, dimostriamo un protocollo di immunohistochimica a fluorescenza ottimizzato utilizzando sezioni di paraffina per visualizzare la formazione di blastema, la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione e la conversione blastemica in osso tramite intramembranous Ossificazione. Dimostriamo anche l’uso di una tasie-invivo sequenziale per identificare i cambiamenti nella morfologia ossea, nel volume e nella lunghezza nella stessa cifra nel corso della rigenerazione. L’obiettivo di questo protocollo è quello di studiare la formazione di blastema mammifero dopo l’amputazione e di dimostrare 2 tecniche, immunohistochimica a fluorescenza e in vivo in vivo sequenziale, per lo studio della rigenerazione ossea intramembrana.
Questo protocollo descrive una procedura standardizzata di amputazione P3 del topo adulto, colorazione immunohistochimica fluorescente per visualizzare e analizzare la formazione di blastema e l’ossificazione intramembranosa, e la scansione sequenziale in-vivo identificare i cambiamenti morfologici ossei, di volume e di lunghezza dopo l’amputazione. L’amputazione P3 è un modello unico, proceduralmente semplice e riproducibile per analizzare un ambiente di ferite pro-rigenerativo che innesca la formazione di blastema. In…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo i membri del Muneoka Lab e del Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Questo lavoro è stato supportato dalla Texas A&M University.
Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
vivaCT 40 | SCANCO Medical |