כריתה של ספרות עכבר למבוגרים והתחדשות: מודל פשוט כדי לחקור ממגי בלסטאמה היווצרות הIntramembranous פיקציה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול של מסוף העכבר למבוגרים פלקים כריתת כריתה לחקור היווצרות בלסטאמה blastema ו intramembranous להתקשות, מנותח על ידי הפלורסנט אימונוהיסטוכימיה ו רציפים ב-vivo מיקרו טומוגרפיית.
Abstract
כאן, אנו מציגים פרוטוקול של העכבר המבוגר מהטרמינל פלנקס (P3) קטיעה, המודל התהליכים פשוטה ומתחדעה של התחדשות אפימורדית, אשר כרוך היווצרות blastema ו intramembranous האוסיפיקציה שנותחו על ידי אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית ו רציפים ב-vivo מיקרו טומוגרפיה (μCT). התחדשות היונקים מוגבלת לקטיעות המעבר באזור המרוחק של הטרמינל (P3); ספרות הנככרות ברמות הגבוהות יותר אינן מצליחות להתחדש ולעבור ריפוי פיברוטי והיווצרות צלקת. תגובת ההתחדשות מתווכת על ידי היווצרות blastema שהתרבות, ואחריו התחדשות העצם דרך intramembranous אוסיפיקציה כדי לשחזר את אורך השלד הקטוע. P3 קטיעה היא מודל טרום קליני לחקור התחדשות אפימורמכולה יונקים, והוא כלי רב עוצמה לעיצוב של אסטרטגיות טיפוליות להחליף ריפוי פיברוטיק עם תגובת התחדשות מוצלחת. הפרוטוקול שלנו משתמש אימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית ל 1) לזהות אוכלוסיות מוקדמות ומאוחרות של בלסטאמה, 2) מחקר revascularization בהקשר של התחדשות, ו 3) לחקור האוסיפיקציה intramembranous ללא צורך בעצם מורכב מכשירי ייצוב. אנו גם להדגים את השימוש רציפים ב vivo μCT כדי ליצור תמונות ברזולוציה גבוהה כדי לבחון שינויים מורפולוגיים לאחר קטיעה, כמו גם לכמת נפח ושינויי אורך באותה ספרה במהלך התחדשות. אנו מאמינים פרוטוקול זה מציע כלי השירות העצום כדי לחקור את התגובות שניהם התחדשות מנוונת ורקמות ביונקים.
Introduction
יונקים, כולל בני אדם ועכברים, יש את היכולת לחדש את קצות הספרות שלהם לאחר הסדר המרוחק של הטרמינל פלנקס (P3)1,2,3. בעכברים, תגובת ההתחדשות היא תלוית ברמת קטיעה; קטיעות הספרות האבותיים יותר ויותר להציג תגובת משובי בהדרגה החליש עד כשל התחדשות מלאה בקטיעות transecting ואת האבובית לתוך P3 מטריצה4,5,6 , מיכל סבן , 8. P3 התחדשות מתווכת על ידי היווצרות blastema, מוגדר כאוכלוסייה של תאים מתרבים העוברים מורפולגנזה כדי לחדש את המבנים הקטוע9. היווצרות של blastema כדי לחדש את המבנים שאבדו על ידי קטיעה, תהליך שנקרא התחדשות אפימורפית, מבדיל את תגובת התחדשות P3 ברמת רקמה מסורתית לאחר פציעה6, 10. P3 התחדשות היא מודל מתהליכים פשוטה לחקור תהליכים רגנרטיבית מורכבים כולל ריפוי הפצע11,12, עצם histolysis11,12, התחדשות העצביםההיקפית14, ו המרה בלסטאל עצם באמצעות intramembranous האוסיפיקציה15.
מחקרים קודמים באמצעות אימונוהיסטוכימיה הוכיחו כי blastema הוא הטרוגנית, נמק העצם, ארוי, ו מתרבים מאוד11,13,15,16. בעקבות קטיעה P3 המוקדמות, הבלסטמה המוקדמת קשורה בתחילה עם קרום העצם הP3 ו אנדוסטנום והוא מאופיין על ידי התפשטות חזקה ו אוסטגנזה המתהווה בסמוך למשטח העצמות15. בעקבות השפלה העצם וסגר הפצע, הטרוגנית blastema נוצר על ידי מיזוג של התאים קרום ולגנוב הקשורים, ואחריו הבידול של רכיבי בלסטאל כולל עצם באמצעות intramembranous האוסיפיקציה . חמש עשרה
תיקון עצם בתגובה לפציעה מתרחשת בדרך כלל על ידי endochondral אוסיפיקציה, כלומר באמצעות סחוס השבר הראשוני המהווה תבנית להיווצרות העצם העוקבים17,18. עצם ארוך intramembranous פיקציה, כלומר, היווצרות העצם ללא ביניים סחוס הרסניות, הוא המושרה בדרך כלל באמצעות מכשירים הסחת דעת מורכבים או קיבעון כירורגי19,20. התגובה התחדשות הספרה הוא מודל טרום קליני המציעה יתרונות על מודלים intramembranous האוסיפיקציה קונבנציונאלי: 1) זה לא דורש פגיעה חיצונית או פנימית הפוסט לעורר intramembranous האוסיפיקציה, 2) זה שבוצעו באמצעות 4 ספרות מכל בעל חיים, ובכך למקסם דגימות תוך מזעור שימוש בעלי חיים, ו 3) רציפים בvivo מיקרו טומוגרפיה (μCT) ניתוח ניתן לבצע בקלות ובמהירות.
במחקר הנוכחי, אנו מציגים את המטוס P3 קטיעה סטנדרטית כדי להשיג תגובה התחדשות חזקה ואיתנה. בנוסף, אנו מדגימים פרוטוקול ממוטב האימונוהיסטוכימיה ממוטבת באמצעות מקטעי פרפין כדי להמחיש היווצרות blastema, revascularization בהקשר של התחדשות, והמרה בלסטאל עצם באמצעות intramembranous תאבנות. אנו גם להדגים את השימוש רציפים ב-vivo μCT כדי לזהות שינויים מורפולוגיה העצם, נפח, ואורך באותה ספרה במהלך התחדשות. המטרה של פרוטוקול זה היא לחקור את היווצרות היונקים בלסטי לאחר קטיעה ולהדגים 2 טכניקות, אימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית ו רציפים ב vivo μCT, לחקר התחדשות העצם intramembranous.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר הליך מתוקננת של העכבר המבוגר הP3 קטיעה, כתמים מבוססי פלורסנט מכתים כדי להמחיש ולחקור היווצרות blastema ו intramembranous האוסיפיקציה, ו רציפים ב-vivo μct סריקה כדי ל זיהוי עצם מורפולוגית, נפח, ואורך שינויים לאחר קטיעה. P3 קטיעה הוא ייחודי, תהליכים פשוטה, מודל ליצירת לנתח סביבה פרו-משובי הפצ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת Muneoka ומכון טקסס לרפואה גנומית (TIGM). העבודה הזאת נתמכת על ידי אוניברסיטת טקסס A & M.
Materials
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
Referências
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
- Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
- Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
- Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Biologia do Desenvolvimento. 315, 125-135 (2008).
- Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
- Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
- Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
- Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. Biologia do Desenvolvimento. 433, 190-199 (2018).
- Carlson, B. M. . Principles of Regenerative Biology. , (2007).
- Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. Biologia do Desenvolvimento. 350, 301-310 (2011).
- Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
- Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
- Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. Biologia do Desenvolvimento. 445, 237-244 (2018).
- Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
- Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
- Einhorn, T. A. The science of fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).
- Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
- Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
- Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. Biologia do Desenvolvimento. 382, 98-109 (2013).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).
