DsDNA enterkalasyon boya kullanarak bu gerçek zamanlı RT-PCR Lissavirüse enfeksiyonları teşhis etmek için uygundur. Yöntem, kuduz şüpheli ante-mortem veya post-mortem örneklerinden çıkarılan RNA ile başlar, ana karışım hazırlama, RNA ilavesi, gerçek zamanlı makinenin kurulumu ve sonuçların doğru yorumlanması hakkında ayrıntı.
Moleküler tanı, hızlı, hassas ve spesifik ve kuduz teşhis için merkezi haline gelmiştir. PCR tabanlı tanılar, kuduz teşhisi onaylamak için yıllardır kullanılmıştır, ancak son zamanlarda kuduz enfeksiyonu tespit etmek için birincil bir yöntem olarak OIS (Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü) tarafından kabul edilmiştir. Gerçek zamanlı RT-PCR sistemleri, gerçek zamanlı veri sağlar ve kapalı boru sistemleridir ve kurulum sırasında kontaminasyon riskini en aza indirir. DNA enterkalasyon fluorokrom gerçek zamanlı RT-PCR deneyleri pahalı problar gerektirmez, örnek başına maliyeti en aza indirmek, ve astar, koruma altındaki bölgelerde tasarlanmış olduğunda, sadece bir virüs özel yerine virüs cins arasında spesifik olan türleri mümkündür. Burada en farklı virüsler ikov, wcbv ve llebv de dahil olmak üzere Lyssavirus cins arasında lyssaviruses algılar bir Pan-Lyssavirus sybr gerçek zamanlı RT-PCR tahlil açıklanmaktadır. Ayrışma eğrisi analizi ile birlikte, bu tahlil hassas ve spesifik, tüm Lissavirüse türlerinin tespiti avantajı ile. Tahlil, hayvan ve insan kuduz vakalarının sağlam, hızlı, hassas tanısı sağlayarak, kaliteli güvence ortamları ile birçok tanı laboratuvarlarında benimsenmiştir.
Moleküler metodolojileri kullanarak kuduz tanısı, 20181‘ de oI tarafından kabul edildi, bu tekniklerin kuduz vakalarının onaylanması, özellikle örneklerin alt-optimum olduğu durumlarda veya ante-mortem tanısı için avantajları tanınması, Canlı virüs veya taze örnekler için hiçbir gereksinimi olduğu gibi. PCR, lyssaviruses için bir ters Transkripsiyon (RT) gerektirdiğinden önce PCR, genom RNA olarak başlayabilir. RT-PCR, genomun 3 ‘ proksimal bölgesini algılamayı, Lissavirüse çoğaltması sırasında transkripsiyonel degradelerin oluştuğu gibi en hassas olarak kabul edildiğini gösteriyor. Yaygın olarak kullanılan RT-PCR deneyleri iki kategoride, son nokta (veya jel tabanlı) ve gerçek zamanlı olarak bölünmüş olabilir. Her iki yaklaşım duyarlı ve özeldir; Ancak, gerçek zamanlı tahlil gibi bazı ek faydaları vardır ‘ gerçek zamanlı ‘ sonuçları elde etmek ve tamamen kapalı bir tüp sisteminde gerçekleştirilen, böylece operatör kontaminasyonu potansiyelini azaltmak. Gerçek zamanlı uygulamalar kullanılarak elde edilen Lyssavirus özel amplikonlar algılamak için iki ana yaklaşımlar vardır. İlk hidroliz probları kullanır (örneğin TaqMan problar) bir fluorophore ve bir Quencher içerir. Prob, amplifikasyon sırasında hedef bölgeye bağlandığında, polimeraz ‘nin eksonükleaz aktivitesi fluorophore ve Quencher ‘ın dağılmasına neden olur ve bu da ortaya çıkan floresans ölçülmesini sağlar. İkinci bir DNA enterkalasyon boya kullanır (fluorokrom sybr yeşil gibi) amplifikasyon sırasında çift sıkışmış DNA bağlar. Bağlı florokromlarla, her döngüde algılanan floresans yayarak ürünün gerçek zamanlı algılanmasını ve ölçülmesini sağlar. Herhangi bir dsDNA bağlama spesifik olmayan doğası nedeniyle, bir ayrışma eğrisi Analizi reaksiyon özgüllüğü onaylamak için üstlenilir. Gerçek zamanlı RT-PCRs küçük amplikon boyutları nedeniyle hızlı, genellikle az 200 BP uzunluğunda; Bununla birlikte, uygun bölgeleri tespit eden alanlarda astar ve problar tasarlamak için, zorlu olabilir, bu nedenle bir prob gereksinimini kaldırmak farklı bir avantajdır.
Bir dizi gerçek zamanlı RT-PCRs özellikle bireysel suşları veya rabv2 sırlarını tespit etmek ve aynı zamanda cins3,4,5,6arasında lyssaviruses algılamak için tasarlanmıştır 7,8,9. Tüm asdaların, astar (ve gerekirse, prob) dizileri cins üzerinde olduğu nasıl bağlı algılama bağımlı bir sınırı olacaktır. Nitekim, ortaya çıkan veya yeni virüs suşları son derece spesifik prob tabanlı etkili etkisiz hale getirebilir. Gerçek zamanlı algılama (boya ve prob) seçimi amaçlanan uygulamaya bağlı olacaktır. Yerel kaynaklı beyin malzemesi üzerinde gözetim yapan ve negatif numunelerin yüksek sayıda beklediği bir laboratuar için, ucuz enterkalasyon boya kullanımı mantıklı bir seçimdir. Sybr yeşil yaklaşımı, aynı zamanda, roman veya farklı lyssaviruses varlığının daha kısıtlı prob bazlı bilgi tarafından algılanmazsa kalacağı tarama gözetimi yaparken de optimum olacaktır.
Cins Lyssavirus tüm üyeleri hastalık kuduz neden, belirtiler görünür kez ölümcül olan. İnsan ve hayvan kuduz vakalarının büyük çoğunluğu kuduz virüsü (RABV), yerli köpek10olan baskın rezervuar kaynaklanmaktadır. Yarasalar lyssaviruses için önemli ev sahibi rezervuarlar ve tüm ama iki Lissavirüse türleri karakterize tüm yarasalar doğrudan tespit edilmiştir-Ikoma Lissavirüse (ıkov) ve mokola virüs (mokv)-ve bu iki, ıkov bir yarasa ev sahibi rezervuar için spekülasyonlar olmuştur 11. 16 tanınan Lissavirüse türünün yanı sıra12, son zamanlarda açıklanan iki lyssaviruses vardır: Tayvan bat Lissavirüse (twblv)13 ve Kotalahti bat Lissavirüse (KBLV)14. Lyssaviruses genetik üç phylogroups bölünebilir, lyssaviruses çoğunluğu ile, RABV dahil, phylogroup ı ait. Ancak, en farklı lyssaviruses phylogroup III aittir ve RT-PCRs rabv veya phylogroup I virüs dizileri hedef için tasarlanmış tarafından algılanması olası değildir.
Tahlil burada açıklanan gerçek zamanlı primer çifti JW12-N165, ilk 2005 içinde açıklanan kullanır3. Astarlar Pan-Lissavirüse olmak için tasarlanmış olsa da orijinal uygulama problar ile bir TaqMan assay olarak Lissavirüse türlerini ayırt etmek oldu. Primer çifti özgüllük Pan-Lissavirüse olduğunu sonraki onay wcbv15dahil olmak üzere tüm Lissavirüse türleri üzerinde 2 adımlı sybr gerçek zamanlı tahlil kullanılarak elde edildi. Primer çifti burada açıklanan bir adım RT-PCR gerçek zamanlı tahlil bir enterkalasyon fluorokrom kullanarak, tüm temsilcileri kullanılarak doğrulanmış 16 tanınan Lissavirüse türleri. Bu bir adım gerçek zamanlı tahlil hızlı, hassas, Lissavirüse özgü tahlil ve astar sağlamlık bile son derece farklı Lissavirüse türleri belirlemek için ayarlanmış olduğunu göstermektedir.
Pan-Lyssavirus gerçek zamanlı RT-PCR tahlil açıklanan bir kapalı-tüp, tüm üç phylogroups arasında lyssaviruses algılar tek adımlı tahlil olduğunu. Tahlil hem hayvan hem de insan kuduz tanısı için doğrulandı, post-mortem beyin dokusu dahil (optimal beyin derisi), ve cilt biyopsisi gibi ante-mortem örnekleri, seri olarak toplanan tükürük, ya da serebral omurilik sıvısı (CSF). Bu tahlil kullanılan astar ilk tasarlanmış ve RABV arasında ayırt etmek için bir prob tabanlı tahlil için kullanılan, EBLV-1 ve EBLV-23, birçok OIE kuduz laboratuvarlarında kullanılan ve eurl yeterlilik şemaları tutarlı bir şekilde gerçekleştirir. Daha sonra bu astar ‘ Pan-Lyssavirus ‘ doğası 2-adım gerçek zamanlı tahlil15kullanılarak teyit edilmiştir. Tahlil burada açıklanan daha da RT-PCR tek adımlı bir SYBR tahlil bir kapalı tüp, hızlı sistem sağlayan optimize etmek için astar kullandı. Ayrıca, bu tahlil kullanarak kuduz endemik ülkelerde eğitim, çapraz kontaminasyon ve iz örneklerini azaltmak için temel KKD ve kalite sistemleri ile herhangi bir laboratuvarda uygulanması uygunluğu doğruladı, reaktifler ve gerçek zamanlı saklamak için tesisler SYBR algılama ile makine. Tahlil son derece sağlam ve yağ ile% 100 korelasyon vardır, deforme örnekleri için gelişmiş hassasiyet ile3. Bir DNA enterkalasyon boya bazlı tahlil bir prob tabanlı tahlil karşılaştırıldığında için ana avantajlardan biri göreli maliyetidir. Ek bir yararı tahlil sadece iki astar kullanır, bu nedenle daha önce yayınlanan prob tabanlı assays bir zayıflık olmuştur sıra divergence nedeniyle başarısız algılama daha az risk vardır. Nitekim, tüm Lissavirüse türlerinin temsilcileri (twblv ve KBLV dışında) bu tahlil kullanılarak tespit edilir, ve primer siteler arasında twblv ve KBLV dizi analizi önemli bir sapma şiddetle onlar da kullanılarak tespit edilecektir düşündüren ortaya çıkarır Bu yöntem. Virüsler arasında gözlenen algılama sınırı aralığı analiz edildi, iki ana faktör nedeniyle olarak kabul edilebilir. Birincisi RNA ‘nın klinik beyin malzemesine göre izole edilmesidir, bu nedenle her seyreltilmiş örnekteki genom kopyaları doğrudan karşılaştırılabilir değildir. RNA, toplam RNA ‘ya 1 μg/μL ‘ye ayarlanarak ‘ normalleştirilmiş ‘; Ancak, bu numune içinde viral genom RNA oranı farklılık gösterecektir. İkincisi, Lissavirüse dizilerinin çeşitliliğindedir, primer sitelere rağmen kullanılan bölgelerde bulunan, varyasyon pozisyonları kalır. Bu nedenle, bu tahlil için daha düşük hassasiyet ile lyssaviruses çoğunluğu phylogroup II ve III virüslerdir şaşırtıcı değildir. Ayrışma eğrisi analizi, primer dimers oluşumu veya konak genomunda spesifik olmayan bir bölgenin amplifikasyonu nedeniyle ortaya çıkabilecek yanlış bir pozitif sonucu minimize eden temel bir parametreyi temsil eder. Gerçekte, bu nadir bir durumdur ve ayrışma eğrisi Analizi doğru boyutta konvansiyonel RT-PCR amplicons görselleştirmek için bir agaroz jel çalıştırmak için eşdeğerdir. Kabul edilebilir Tm değerleri yelpazesi, laboratuvarımızda toplanan verilere dayanarak (77-80 °c) sağlandı. Bireysel laboratuvarların kapsama alanı aktarılabilir ve buna göre değişiklik olmasını sağlamak için ev içi verileri harmanlarına şiddetle tavsiye edilir. Hem amplifikasyon hem de dağılma arazileri arasındaki sonuçların yorumlanması, pozitif ve negatif kontroller ve β-aksin sonuçlarının yanı sıra, sağlam ve yeniden üretilebilen teşhis sonuçları sağlar.
Bu protokol kapsamı dışında yüksek kaliteli RNA elde etmek için kullanılan RNA ekstraksiyon yöntemidir. Bu protokolde analiz edilen tüm RNA TRIzol kullanılarak hazırlanmıştır; Ancak, sütun ve boncuk bazlı ekstraksiyon kitleri de dahil olmak üzere birçok uygun guanidium tabanlı çıkarma RNA ekstraksiyon protokolleri mevcuttur. Lissavirüse pozitif (ya da olumlu şüpheli) numunelerin kullanımı ülke içinde onaylanmış lisanslı biyokapsama tesisleri içinde olmalıdır. Ancak, çıkarılan toplam RNA enfeksiyöz değildir, bu nedenle düşük koruma laboratuvarları içinde işlenir. Kullanılan ekstraksiyon yöntemine bağlı olarak RNA ‘nın ölçülmesine ve seyrelmeye ihtiyacı değerlendirilmelidir. TRIzol dahil fenol bazlı çıkarma için, bu adım gereklidir ve gDNA kontamine gelen tahlil inhibisyonu önler; Ancak, sütun ve boncuk bazlı çıkartmalar (özellikle DNA tükenmesi aşamasına sahip olanlar) test öncesinde seyreltme gerektirmez.
Protokol boyunca, bakım ve özen doğru kuyuları için çapraz kontaminasyon ve numune doğru ilavesi önlemek için kullanılan esastır. Reaktif hesaplamaları ve plaka düzenini içeren bir elektronik tablo, ek bir dosya olarak indirilmek üzere kullanılabilir. Temiz çalışma yüzeyleri, düzenli eldiven değişimi, bariyer ipuçları kullanımı ve her aşamayı ayırmak için farklı odalar/UV dolapları gibi iyi bir laboratuar uygulaması, kontaminasyon olasılığını en aza indirir. Test beklenen parametrelerle performans sağlamak için pozitif ve negatif denetimler dahil edilmelidir ve tüm test örnekleri yinelenen (veya triplicate) çalıştırın.
Denetimlerin eklenmesi, özellikle Tanılama için herhangi bir PCR ‘nin önemli bir özelliğidir. Pozitif kontrol RNA CVS (Challenge virüs standardı) enfekte fare beyni toplu olarak hazırlanmış ve doğrulanmış ve gruplar arasında tutarlılık sağlamak için kalibre edilmiştir. Kontrol RNA ‘sı, en az 10-4 ‘ e kadar (100 pg/μL ‘ye eşit) bir seri seyreltme sırasında pozitif bir sonuç elde edilen 1 μg/ΜL. RNA ‘ya göre nicelik ve seyreltilmiş bir amaca uygun olarak kabul edildi. Pozitif kontrol RNA 10-1 aliquots-80 °c ‘ de saklanır. Gerektiğinde, 1 ng/μL ‘de çalışma stokları sağlamak ve 5 μL tek kullanımlık aliquots ‘da-80 °c ‘ de saklanan bir kısım 1:100 seyreltilmiş. Seyreltilmiş pozitif kontrol RNA ‘sı düşük seviyeli pozitif numuneleri temsil etmek ve tahlil hassasiyetindeki herhangi bir azalma tespit edildiğinden emin olmak için kullanılmıştır. Ct değerlerini izlemek ve trendleri belirlemek için her kontrol için bir ‘ kontrol kartı ‘ tutuldu (Tablo 5). Tablo 5 , birden çok gün ve operatörler arasında CVS pozitif kontrol örneği Ct ve tm değerleri için iyi bir inter-Run karşılaştırılması gösterdi, tahlil sağlam ve tekrarlanabilir olduğunu güvence sağlar. Bu ölçümlerden sapacak sonuçlar araştırılmalıdır ve gerekirse test numuneleri tekrarlanmalıdır. Reaktiflerin Lissavirüse RNA ile kontaminasyondan serbest olduğunu ve negatif bir numuneyi onaylaması için bir NTC olarak her koşunun moleküler sınıf suyu dahil edildi. Ayrıca, RNA ekstraksiyon etkinliğini sağlamak için, β-aksini test örneklerinin yanında ayrı bir tüpte test edildi. Β-aksin pozitif kontrolü için Lissavirüse pozitif kontrol RNA ‘sı da kullanılmıştır. Diğer endojen genler veya heterolog iç kontrol sistemleri kullanılabilir. Bu denetimlerin kullanımı, tüm adımların test örnekleriyle aynı koşullarda çözümlenmesi sağlanır. Bazen, örnek son derece düşükmüş veya yeterli ana RNA (örneğin, tükürük veya CSF) içermiyorsa, endojen gen PCR başarısız olabilir. Bu örnekte, Lissavirüse gerçek zamanlı RT-PCR sonucu pozitif olduğu, bağımsız RNA ekstraksiyonu üzerinde onay-orijinal testte RNA ekstraksiyon veya ikincil bir test (konvansiyonel RT-PCR gibi moleküler,) sırasında kontaminasyon dışarı kural veya FAT. Tablo 4 ‘ ün tanılama numunesi analizi sırasında kullanımı doğru yorumu sağladı.
Ne olursa olsun moleküler tahlil kuduz enfeksiyonu onaylamak için kullanılan, soruşturma takip Sanger sıralamayı kullanarak Lissavirüse türleri ve virolojide FAT veya virüs yalıtımı gibi klasik teknikleri belirlemek için de izin almak için üstlenilmesi gereken daha fazla virüs karakterizasyonu ve pozitif olguların OIS ve WHO ‘ya bildirilmesini destekler.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, deneyler tamamlanmasında yardım için Miss Emma wise ve Miss Megan Golding teşekkür etmek istiyorum. Bu protokolün geliştirilmesi finansal olarak INGILTERE bölümü çevre, gıda ve kırsal Işler (DEFRA), Iskoç hükümeti ve Welsh hükümeti tarafından hibe [SV3500 ve SE0431] tarafından ve Avrupa virüs Arşivi Global (EVAg) projesi tarafından desteklenmektedir Avrupa Birliği ‘nin Horizon 2020 araştırma ve İnovasyon programından fon alındı, Grant anlaşması kapsamında No 653316.
Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
Centrifuge (mico) | Sigma | ||
Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 µL) | Thermofisher | various | |
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
Unless stated, alternative equipment can be used |