Ce RT-PCR en temps réel utilisant le colorant intercalateur de dsDNA est approprié pour diagnostiquer des infections de lyssavirus. La méthode commence par l’ARN extrait d’échantillons pré-mortem ou post-mortem soupçonnés de rage, détaillant la préparation du mélange maître, l’ajout d’ARN, la configuration de la machine en temps réel et l’interprétation correcte des résultats.
Les essais moléculaires sont rapides, sensibles et spécifiques, et sont devenus essentiels au diagnostic de la rage. Des tests basés sur la PCR ont été utilisés pendant des décennies pour confirmer le diagnostic de la rage, mais n’ont été acceptés que récemment par l’OIE (Organisation mondiale de la santé animale) comme méthode primaire pour détecter l’infection à la rage. Les essais RT-PCR en temps réel fournissent des données en temps réel et sont des systèmes à tube fermé, ce qui minimise le risque de contamination pendant la configuration. L’intercalation de l’ADN fluorochrome en temps réel RT-PCR essais ne nécessitent pas de sondes coûteuses, en minimisant le coût par échantillon, et lorsque les amorces sont conçus dans les régions conservées, les essais qui sont spécifiques à travers les genres de virus plutôt que spécifique à un seul virus espèces sont possibles. Ici, nous décrivons un pan-lyssavirus SYBR en temps réel RT-PCR analyse qui détecte les lyssavirus à travers le genre Lyssavirus, y compris les virus les plus divergents IKOV, WCBV et LLEBV. En conjonction avec l’analyse de la courbe de dissociation, cet analyse est sensible et spécifique, avec l’avantage de détecter toutes les espèces de lyssavirus. L’analyse a été adoptée dans de nombreux laboratoires de diagnostic avec des environnements de qualité assurés, permettant un diagnostic robuste, rapide et sensible des cas de rage animale et humaine.
Le diagnostic de la rage à l’aide de méthodologies moléculaires a été accepté par l’OIE en 20181, reconnaissant les avantages de ces techniques dans la confirmation des cas de rage, en particulier dans les situations où les échantillons sont sous-optimaux, ou pour le diagnostic ante-mortem, qu’il n’y a pas d’exigence pour le virus vivant ou des échantillons frais. Les tests de PCR pour les lyssavirus nécessitent une transcription inversée (RT) avant que PCR puisse commencer car le génome est ARN. Les tests RT-PCR qui détectent la région proximale de 3′ du génome sont considérés comme les plus sensibles, car les gradients transcriptionnels se produisent pendant la réplication du lyssavirus. Les essais RT-PCR couramment utilisés peuvent être divisés en deux catégories, le point final (ou à base de gel) et en temps réel. Les deux approches sont sensibles et spécifiques; cependant, l’essai en temps réel présente certains avantages supplémentaires, comme l’obtention de résultats en « temps réel » et l’exécution dans un système de tube entièrement fermé, réduisant ainsi le risque de contamination de l’opérateur. Il existe deux approches principales pour détecter les amplicons spécifiques au lyssavirus obtenus à l’aide d’analyses en temps réel. La première utilise des sondes d’hydrolyse (comme les sondes TaqMan) qui contiennent un fluorophore et un quencher. Lorsque la sonde se lie à la région cible pendant l’amplification, l’activité d’exonuclage de la polymérase entraîne la dissociation du fluorophore et du quencher, ce qui permet de mesurer la fluorescence résultante. Le second utilise un colorant intercalateur d’ADN (fluorochrome tel que SYBR Green) qui se lie à l’ADN double brin pendant l’amplification. Les fluorochromes liés émettent de la fluorescence détectée à chaque cycle, ce qui permet la détection et la quantification en temps réel du produit. En raison de la nature non spécifique de la liaison à toute dsDNA, une analyse de la courbe de dissociation est entreprise pour confirmer la spécificité de la réaction. Les RT-PCR en temps réel sont rapides en raison des petites tailles d’amplicon, généralement moins de 200 bp de longueur ; cependant, l’identification de régions appropriées pour concevoir des amorces et des sondes dans les régions conservées, peut s’avérer difficile, donc la suppression de l’exigence d’une sonde est un avantage distinct.
Un certain nombre de RT-PCR en temps réel ont été conçus pour détecter spécifiquement les souches individuelles ou les lignées de RABV2 et aussi pour détecter les lyssavirus à travers le genre3,4,5,6, 7,8,9. Tous les essais auront une limite de détection en fonction de la façon dont conservé l’amorce (et si nécessaire, la sonde) séquences sont à travers le genre. En effet, les souches virales émergentes ou nouvelles peuvent rendre les essais très spécifiques basés sur la sonde inefficaces. Le choix de la détection en temps réel (teinture vs sonde) dépendra de l’application prévue. Pour un laboratoire effectuant une surveillance sur du matériel cérébral d’origine locale et s’attendant à un nombre élevé d’échantillons négatifs, l’utilisation du colorant intercalateur moins cher est un choix judicieux. L’approche SYBR Green serait également optimale lorsqu’il s’agirait d’effectuer une surveillance de balayage lorsque la présence de lyssavirus nouveaux ou divergents ne serait pas détectée par des essais plus restreints basés sur des sondes.
Tous les membres du genre Lyssavirus causent la rage de la maladie, qui est mortelle une fois que les symptômes apparaissent. La grande majorité des cas de rage humaine et animale sont dus au virus de la rage (RABV), dont le réservoir dominant est le chien domestique10. Les chauves-souris sont d’importants réservoirs hôtes pour les lyssavirus et toutes les espèces de lyssavirus, sauf deux, caractérisées ont été identifiées directement chez les chauves-souris — le lyssavirus d’Ikoma (IKOV) et le virus Mokola (MOKV) — et de ces deux espèces, IKOV a été spéculée pour avoir un réservoir d’hôte de chauve-souris 11. En plus des 16 espèces reconnues de lyssavirus12,il y a deux lyssavirus qui ont été récemment décrits : le lyssavirus de chauve-souris de Taiwan (TWBLV)13 et le lyssavirus de chauve-souris de Kotalahti (KBLV)14. Les lyssavirus peuvent être génétiquement divisés en trois phylogroupes, la majorité des lyssavirus, y compris le RABV, appartenant au phylogroupe I. Cependant, les lyssavirus les plus divergents appartiennent au phylogroupe III et sont peu susceptibles d’être détectés par rt-PCR conçus pour cibler les séquences de virus RABV ou phylogroupe I.
Le scarest décrit ici utilise la paire de primer en temps réel JW12-N165, décrite pour la première fois en 20053. Les amorces ont été conçues pour être pan-lyssavirus bien que l’application originale était comme un analyse TaqMan avec des sondes pour différencier les espèces de lyssavirus. La confirmation ultérieure que la paire d’amorce était pan-lyssavirus dans la spécificité a été réalisée en utilisant un sYBR en 2 étapes d’analyse en temps réel sur toutes les espèces de lyssavirus disponibles, y compris WCBV15. La paire d’amorce est décrite ici dans un exemple en temps réel RT-PCR en une seule étape utilisant un fluorochrome intercalant, validé à l’aide de représentants des 16 espèces reconnues de lyssavirus. Cet analyse en temps réel en une seule étape est un test rapide, sensible, spécifique au lyssavirus et démontre que la robustesse de l’amorce vise à identifier même les espèces de lyssavirus très divergentes.
Le test de test RT-PCR en temps réel du panlyssavirus décrit est un essai à tube fermé en une seule étape qui détecte les lyssavirus dans les trois phylogroupes. L’analyse a été validée pour le diagnostic de la rage animale et humaine, y compris le tissu cérébral post-mortem (optimaldu le tronc cérébral), et les échantillons ante-mortem tels que la biopsie de peau, la salive en série, ou le fluide céphalo-rachidien (CSF). Les amorces utilisées dans cet analyse ont d’abord été conçues et utilisées pour un analyse à base de sondes pour différencier RABV, EBLV-1 et EBLV-23, qui a été utilisé dans de nombreux laboratoires de la rage de l’OIE et effectue régulièrement dans les systèmes de compétence EURL. Par la suite, la nature «pan-lyssavirus» de ces amorces a été confirmée à l’aide d’un 2-step en temps réel d’analyse15. Le test décrit ici a utilisé les amorces pour optimiser davantage la RT-PCR dans un essai SYBR en une seule étape permettant un tube fermé, système rapide. En outre, la formation dans les pays d’endémie de la rage utilisant cet analyse a confirmé l’aptitude à mettre en œuvre dans n’importe quel laboratoire avec l’EPI de base et des systèmes de qualité pour réduire la contamination croisée et des échantillons de traces, des installations pour stocker les réactifs et un temps réel machine avec détection SYBR. L’analyse est extrêmement robuste et a 100% de corrélation avec le FAT, avec une sensibilité améliorée pour les échantillons décomposés3. L’un des principaux avantages d’un colorant intercalateur d’ADN basé sur l’analyse par rapport à un test basé sur la sonde est le coût relatif. Un avantage supplémentaire est que l’analyse n’utilise que deux amorces, donc il ya moins de risque de détection échouée en raison de la divergence de séquence, qui a été une faiblesse dans les essais précédemment publiés à base de sondes. En effet, les représentants de toutes les espèces de lyssavirus (à l’exception de TWBLV et KBLV) sont détectés à l’aide de cet analyse, et l’analyse de la séquence de TWBLV et KBLV à travers les sites d’amorce ne révèle aucune divergence significative suggérant fortement qu’ils seront également détectés en utilisant cette méthode. La plage de limite de détection observée dans les virus analysés peut être considérée comme due à deux facteurs principaux. La première est que l’ARN a été isolé du matériel clinique du cerveau, donc la quantité de copies du génome dans chaque échantillon non dilué n’est pas directement comparable. L’ARN a été « normalisé » en ajustant l’ARN total à 1 g/L; cependant, la proportion d’ARN du génome viral dans cet échantillon variera. La deuxième est la diversité des séquences de lyssavirus, malgré les sites d’amorce situés dans des régions conservées, il reste des positions de variation. Par conséquent, il n’est pas surprenant que la majorité des lyssavirus avec une sensibilité plus faible pour l’analyse sont des virus phylogroupe II et III. L’analyse de la courbe de dissociation représente un paramètre essentiel, minimisant un résultat faussement positif qui pourrait autrement se produire en raison de la formation de diététistes d’apprêt, ou de l’amplification d’une région non spécifique dans le génome hôte. En réalité, il s’agit d’un événement rare et l’analyse de la courbe de dissociation équivaut à l’exécution d’un gel d’agarose pour visualiser les amplicônes RT-PCR conventionnels de taille correcte. La gamme de valeurs tm acceptables a été fournie (77-80 oC), sur la base des données recueillies dans notre laboratoire. Il est fortement recommandé que les laboratoires individuels rassemblent des données internes pour s’assurer que la plage est transférable et modifier en conséquence. L’interprétation des résultats des parcelles d’amplification et de dissociation, ainsi que les contrôles positifs et négatifs et les résultats de l’actine, permet des résultats diagnostiques robustes et reproductibles.
En dehors de la portée de ce protocole est la méthode d’extraction de l’ARN utilisé pour obtenir de l’ARN de haute qualité. Tout l’ARN analysé dans ce protocole a été préparé utilisant TRIzol ; cependant, il existe de nombreux protocoles d’extraction d’ARN à base de guanidium appropriés disponibles, y compris des kits d’extraction à base de colonnes et de perles. La manipulation d’échantillons de lyssavirus positifs (ou présumés positifs) doit se faire dans des installations de biocontenu autorisées approuvées à l’intérieur du pays. Cependant, l’ARN total extrait est non infectieux, donc manipulé dans les laboratoires de faible confinement. Selon la méthode d’extraction utilisée, l’exigence de quantifier et de diluer l’ARN devrait être évaluée. Pour les extractions à base de phénol, y compris le TRIzol, cette étape est nécessaire et empêche l’inhibition de l’analyse de contaminer l’ADNc; cependant, les extractions à base de colonnes et de perles (en particulier celles qui ont un stade d’épuisement de l’ADN) ne nécessitent pas de dilution avant les essais.
Tout au long du protocole, il est essentiel que les soins et la diligence soient utilisés pour prévenir la contamination croisée et l’ajout précis d’échantillons aux puits corrects. Une feuille de calcul avec les calculs de réactif et la disposition de la plaque est disponible pour téléchargement en tant que fichier supplémentaire. Une bonne pratique de laboratoire, y compris des surfaces de travail propres, des changements réguliers de gants, l’utilisation de pointes de barrière et différentes pièces/armoires UV pour séparer chaque étape, réduira au minimum les risques de contamination. Pour s’assurer que le test fonctionne avec les paramètres attendus, des contrôles positifs et négatifs doivent être inclus et tous les échantillons de test exécutés en double (ou triple).
L’inclusion des contrôles est une caractéristique essentielle de tout PCR, en particulier pour les diagnostics. L’ARN de contrôle positif a été préparé à partir de cerveaux de souris infectés par CVS (défi virus standard) par lots et validé et calibré pour assurer la cohérence entre les lots. L’ARN témoin a été quantifié et dilué à 1 ‘g/L. L. L’ARN pour lequel un résultat positif a été obtenu dans une dilution sérielle jusqu’à au moins 10-4 (égal à 100 pg/L) a été jugé apte à l’usage. L’ARN de contrôle positif a été stocké à -80 oC dans 10-1 aliquots. Au besoin, un aliquot a été dilué 1:100 pour fournir un stock de travail à 1 ng/L et stocké à -80 oC dans 5 aliquots à usage unique. L’ARN de contrôle positif dilué a été utilisé pour représenter des échantillons positifs de faible niveau et pour s’assurer que toute réduction de la sensibilité de l’analyse a été détectée. Une « carte de contrôle » a été conservée pour chaque contrôle afin de surveiller les valeurs Ct et d’identifier les tendances (tableau 5). Le tableau 5 a démontré une bonne comparabilité intermanche pour les valeurs de l’échantillon de contrôle positif CVS Ct et Tm sur plusieurs jours et les opérateurs, ce qui a donné l’assurance que l’essai est robuste et reproductible. Les résultats qui s’écartent de ces mesures doivent être étudiés et tester des échantillons répétés si nécessaire. L’eau de qualité moléculaire a été incluse dans chaque course comme NTC pour confirmer que les réactifs étaient exempts de contamination par l’ARN de lyssavirus et confirmer un échantillon négatif. De plus, pour assurer l’efficacité de l’extraction de l’ARN, l’actine a été testée à côté des échantillons d’essai dans un tube séparé. L’ARN de contrôle positif de lyssavirus a été également employé pour le contrôle positif de l’actine. D’autres gènes endogènes ou systèmes de contrôle interne hétérologues peuvent être utilisés. L’utilisation de ces contrôles a permis de s’assurer que toutes les étapes étaient analysées dans les mêmes conditions que les échantillons d’essai. De temps en temps, si l’échantillon était fortement dégradé ou ne contenait pas suffisamment d’ARN hôte (comme la salive ou le CSF), le gène endogène PCR peut échouer. Dans ce cas, où le résultat RT-PCR en temps réel du lyssavirus était positif, confirmation sur une extraction indépendante d’ARN – pour exclure la contamination pendant l’extraction d’ARN sur le test original ou par un essai secondaire (moléculaire, tel que RT-PCR conventionnel) , ou FAT. L’utilisation du tableau 4 lors de l’analyse d’un échantillon diagnostique a assuré la bonne interprétation.
Indépendamment de l’analyse moléculaire utilisée pour confirmer l’infection à la rage, des enquêtes de suivi utilisant le séquençage de Sanger pour déterminer l’espèce de lyssavirus et les techniques classiques en virologie telles que la FAT ou l’isolement de virus devraient également être entreprises pour permettre d’autres caractérisations virales et soutiennent la notification de cas positifs à l’OIE et à l’OMS.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Mlle Emma Wise et Miss Megan Golding pour leur aide dans la réalisation des expériences. L’élaboration de ce protocole a été soutenue financièrement par le ministère britannique de l’Environnement, de l’Alimentation et des Affaires rurales (Defra), le gouvernement écossais et le gouvernement gallois par des subventions [SV3500, et SE0431] et par le projet global European Virus Archive (EVAg) qui a a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention no 653316.
Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
Centrifuge (mico) | Sigma | ||
Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 µL) | Thermofisher | various | |
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
Unless stated, alternative equipment can be used |