광견병 진단을 위한 팬-리사바이러스 실시간 RT-PCR

상기서에 기술된 프로토콜에 이어, 범용리사바이러스 RT-PCR의 감도는 제어 표준 바이러스(CVS)의 희석 계열에서 입증되었다(그림 1) 및 기타 리사 바이러스 ()그림 2및그림 3). SYBR Green I 염료는 cDNA 합성 및 PCR 증폭이 단일 튜브에서 수행되는 범용 원스텝 RT-PCR로 활용되었습니다. 특정 대상의 증폭이 발생하면 더 많은 염료가 결합되어 실시간으로 형광 수준이 증가합니다. 모든 염료 간 실시간 해석은 증폭 및 해리의 두 단계로 해석되어야 합니다. 증폭 단계는 실시간 증폭과 동일합니다(그림 1A). 배경과 관련하여 부족한 신호로 인해 DNA 증폭을 계산할 수 없는 초기 주기 동안 선형 ‘초기 단계’가 있습니다. 이 길이는 샘플의 대상 양과 직접 관련이 있습니다. 그 후, DNA 분자의 두 배가 검출되고 기록되는 지수 단계가 있습니다. 마지막으로, 고원 상에 도달 (떨어져 프로그램의 종료 전에이 단계에 도달하지 않을 수 있습니다 고희석 샘플에서). 이 단계에서는 시약의 고갈로 인해 형광 의 강도가 나뉩습니다. CVS의 10배 직렬 희석을 사용하여 관찰된 증폭 플롯은 예상 플롯(그림 1AC) 여기서 여기서 리사바이러스 분석법은 ß-액틴 분석법보다 더 높은 민감도를 보였다. 해리 곡선은 증폭 후 계산되었으며, 여기서 dsDNA는 온도의 점진적 증가와 온도의 함수로서 모니터링된 형광에 의해 ssDNA로 해리되었다(그림 1B, D-F). 특정 앰플리콘이 ssDNA로 해리되는 임계 온도는 열순환기 소프트웨어 (T)에 의해 측정 된 형광의 방출을 일으켰습니다.M). 이 해리 단계는 앰플리콘 크기에 대한 데이터를 제공하여 사용자가 긍정적인 대조군과 비교하여 결과를 해석할 수 있게 하여 거짓 긍정 결과의 가능성을 무시할 수 있습니다. 더 TM범용리사바이러스 분석()그림 1B) 및 ß-액틴 분석 (그림 1D)는 구별되며, 사용자가 T를 지적하여 올바른 분석 분석을 확인하는 데 도움을 주었다.M(그림 1E). 또한, CT및 TM실행과 연산자 간의 값을 평가하고 재현 가능한 것으로 나타났습니다(표 5). C를 계산하는 데 사용되는 임계값T값은 소프트웨어에 의해 자동으로 계산되었으며 사용되는 반응 믹스 또는 계측기를 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. 12개의 독립적인 실행 에서 평균 CT20.66(SD 0.63)을 용사바이러스 분석법에 대해, 27.5(SD 1.13)에 대해 ß-액틴 분석하였다. 대조적으로 T에서 관찰된 변형M이 측정에 대한 외부 영향이 없기 때문에 값이 현저히 낮았습니다. 예를 들어, 평균 TMCVS 용리 바이러스 분석의 경우 78.92 (SD 0.16) (표 5), 모든 리사바이러스의 평균과 비교했을 때 78.81 °C (SD 0.531) (표 6및그림 1F). T의 변화의 이 부족M가로 질러 Lyssavirus동일한 대조군 RNA가 시료에서 리사바이러스에 관계없이 사용될 수 있는 것과 같이, 그러나 T를 사용하여 lyssavirus 종 사이 분화하는 것이 유리하다M다른 RABV 서브 리니지T의 범위에 걸쳐 있기 때문에 특히 불가능M관찰된 값(표 6). 비특이적 증폭 플롯은 이 분석으로 거의 관찰되지 않습니다. 그러나 양수 결과와 비특이적 음수 결과를 정의하는 특정 매개변수가 필요합니다. 모든 라이사바이러스(0.531)에서 관찰된 SD는 가장 낮은(77.34- LBVa) 및 가장 높은(79.67- IKOV)에 적용되었다.M양수 특정 대역에 대해 76.8°C – 80.2°C 범위를 설정하는 값입니다. 따라서 TM이 범위를 벗어난 값은 비특이적이므로 음수 결과로 간주되었습니다. 때때로 샘플에 대해 여러 개의 피크가 관찰됩니다. 지배적 인 피크가 올바른 T에있는 경우M(각 복제에 대해) 샘플은 양수로 간주됩니다. 비특이적 피크가 관찰되는 가장 일반적인 이유는 프라이머-디머에 기인하며, 분석제는 프라이머 이완기를 최소화하도록 최적화되었다. 프라이머 이완제는 일반적으로 대상 시퀀스의 암플리폰보다 작아지므로 T가M특정 제품보다 낮습니다. TRIzol을 사용하여 추출된 3개의 lyssavirus 양성 뇌 샘플 RNA의 10배 직렬 희석을 병렬로 실행하고 플롯하였다(도 2). 3개의 lyssaviruses에 대한 검출의 한계는 다양했지만, 아무도 Ct 36을 초과하지 않았다. 그림 2에서 플롯된 바이러스에 대한 R2 계수 값은 0.9637 및 0.996범위입니다. 분석된 모든바이러스에 대해(표 6) 범위가 이를 초과하지 않았고, 또한, 29개의 리사바이러스 중 7개에는 R2>0.99(데이터가 도시되지 않음)가 있었다. 희석 계열의 제조가 총 RNA 추출로부터 의한 것이라는 점을 고려하여, 관찰된 선형성은 분석이 견고하다는 증거를 제공한다. 마지막으로, 모든 리사바이러스 종(특히 가장 다양한 필로그룹 III 바이러스)의 검출은 Lyssavirus 속의 모든 3개의 필로그룹에 걸친 RNA의 패널을 사용하여 조사되었다. RNA는 본래 또는 실험적으로 감염된 마우스, 뇌 물질로부터 추출하였고, 전술한 프로토콜을 이용하여 활용하였다. 상기 결과는 프라이머가 발산하는 필로자바이러스 IKOV, WBCV 및 LLEBV를 포함하는 모든 용리바이러스 종을 증폭시키는 것을 확인하였다(표6 및 도3). 비-리사바이러스 rhabdoviruses의 다양한 패널은, 원래 항원적으로16을 수집하고 분석하였고, 최근에는 유전적으로17개가 스크리닝되었고, 노크로스 반응성이 검출되었고, 이는 프라이머가 특이적임을 나타낸다. Lyssavirus 속의 구성원만(데이터가 표시되지 않음). 범리사바이러스 실시간 분석기는 2013년부터 EURL(EU 기준 실험실) 간 숙련도 체계에 포함되었으며, 범리사바이러스 TaqMan 분석및 와 같은 다른 분자 분석과 100% 일치를 입증하고 있습니다. FAT (형광 항체 테스트) 이외에 기존의 RT-PCR 분석. 도 1: CVS 양성 대조군 RNA의 10배 직렬 희석, 범용 리사바이러스 RT-PCR 분석법에서 실행, 증폭 플롯(A) 및 해리 곡선(B)으로 시각화하고, 증폭 플롯(C)으로 시각화된 ß-액틴 RT-PCR 분석법에서 실행되고, 해리 곡선 (D). NTC = 템플릿 컨트롤이 없습니다. CVS 대조군 RNA의 비교는 범-리사바이러스 RT-PCR 분석법(파란색)과 상해 곡선(E)의 차이를 보여주는 ß-actin RT-PCR 분석법(빨간색)에서 모두 실행된다―평균값에 대한 표 5를 참조; 그리고 마지막으로 LBVa(파랑) 및 IKOV(적색)에 대한 해리 곡선은 리사바이러스 속(F)에서 관찰된 Tm 값의 범위를 시상한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 3개의 lyssavirus 종에 대한 10배 직렬 희석: RABV (RV108), DUVV (RV131) 및 ARAV (RV3379). R2 = 0.996, 0.9962 및 0.9637. 10-7(0.0001 ng/μL)의 데이터 포인트가 검출 한계에 도달했습니다(값을 얻은 위치). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: Lyssavirus 속을 가로지르는 대표적인 10배 직렬 희석 데이터(다른 lyssaviruses와 비교하여 표화된 결과에 대한 lyssavirus ID 및 표 6에 대한 개별 범례 참조). 패널 A, C, E, G 증폭 플롯 및 B, D, F, H 해리 곡선 A, C, E 및 G각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 시약 μL/반응 분자 등급의 물 7.55 2x 범용 RT PCR 반응 믹스 10개 프라이머 포워드 [20 μM] 0.6 프라이머 리버스 [20 μM] 0.6 RT 효소 믹스 0.25 반응당 총 19세 표 1: 팬-리사바이러스 실시간 RT-PCR 마스터 믹스 시약. 시험 프라이머 이름 프라이머 역할 시퀀스 5′-3’ 위치1 리사 바이러스 JW12 RT-PCR ATG 타아 CAC CYC TAC AAT G 53-73 N165 Pcr GCA GGG 테이 TTR TAC TCA TA 165-146 ß-액틴 ß-액틴 인트로닉 Pcr CGA TGA 아가 TCA AGA TCA TTG 1051-1072 ß-액틴 역 RT-PCR AAG CAT TTG CGG TGG AC 1204-1188 프라이머 위치는 파스퇴르 바이러스 서열(M13215) 및 마우스 ß-액틴 유전자 서열(NM_007393)과 관련하여 주어진다. 표 2: 팬-리사바이러스 실시간 RT-PCR 프라이머 세부 정보. 단계 사이클 온도 시간 데이터 수집 역전사 1개 50 °C 약 10분 RT 불활성화/초기 변성 1개 95 °C 약 5분 증폭 40 95 °C 10s 60 °C 30s 끝점 해리 곡선 해석 1개 9 °C 1분 55 °C 1분 55 – 95 °C 10s 모든 점 표 3: 팬-리사바이러스 실시간 RT-PCR 사이클링 조건. 테스트 결과 내부 ß-액틴 제어 전체 결과 부정적인 음수1 올바르지 않음. 반복 추출 및 분석2 부정적인 긍정적인 부정적인 결과가 보고되었습니다. 긍정적인 긍정적인 긍정적인 결과가 보고되었습니다. 긍정적인 음수1 반복 추출 및 분석3 1개 이종 외부 제어의 사용은 반복 추출 하는 동안 도움이 될 것 이다. 2개 내부 대조군을 위해 두 번째 음의 결과를 얻은 경우, 샘플은 이 분석실험에 의해 시험할 수 없는 것으로 보고될 것이다. 3개 내부 통제에 대해 두 번째 부정적인 결과가 얻어지면 양성 테스트 결과와 함께 이차 광견병이 발생합니다. 이 결과를 확인하기 위해 진단 테스트를 수행해야 합니다. 표 4: 범리사바이러스 실시간 RT-PCR에 대한 결과 및 전반적인 결과 요약. 음수는 Ct 값(증폭) 및 용융 온도(해리) 또는 양성 용해 바이러스(76.8°C- 80.2°C)에 대한 Tm 범위를 벗어난 용융 온도가 없는 시료에 지정됩니다. 양성은 양성 용해바이러스에 대한 Tm 범위 의 내부에 있는 Ct 값(증폭) 및 용융 온도(해리)를 가진 시료에 지정된다. 리사바이러스 분석 ß-액틴 분석 코네티컷 Tm 코네티컷 Tm 의미 20.66 78.92 27.5 85.26 Sd 0.63 0.16 1.13 0.35 LCL (95%) 19.39 78.59 25.23 84.56 UCL (95%) 21.93 79.25 29.76 85.96 표 5: 여러 연산자등 12개의 독립 실행에서 CVS 포지티브 컨트롤의 상호 실행 분석. 필로그룹 종 바이러스 ID 계보 감지 한계 Tm Ⅰ RABV RV50 미국 박쥐 10-5 79.5 Ⅰ RABV RV51 미국 폭스 10-7 77.6 Ⅰ RABV RV108 칠레 박쥐 10-7 78.63 Ⅰ RABV RV313 유럽 여우 10-9 78.53 Ⅰ RABV RV437 유럽 락독 10-7 78.09 Ⅰ RABV RV1237 유럽 사슴 10-8 78.76 Ⅰ RABV RV334 중국 백신 10-8 79.03 Ⅰ RABV RV102 아프리카 2 10-7 78.58 Ⅰ RABV RV995 아프리카 3a 10-8 79.66 Ⅰ RABV RV410 아프리카 3b 10-7 79.03 Ⅰ RABV RV2324 아프리카 4 10-7 79.17 Ⅰ RABV RV2417 스리랑카 개 10-9 78.71 Ⅰ RABV CVS-11 10-7 79.17 Ⅰ EBLV-1 RV20 독일 10-6 79.05 Ⅰ EBLV-2 RV1787 영국 10-7 78.76 Ⅰ BBLV RV2507 독일 10-9 78.71 Ⅰ ABLV RV634 10-8 78.25 Ⅰ 듀브 ()에 듀브 ()에 ( RV131 10-5 79.03 Ⅰ GBLV RV3269 10-7 79.15 Ⅰ 아라브 (주) RV3379 10-7 79.46 Ⅰ KHUV (주) RV3380 10-7 78.97 Ⅰ 시브브 (주)(주)(주 RV3381 10-7 78.59 Ⅰ IRKV RV3382 10-3 78.59 Ii LBVa RV767 10-5 77.34 Ii LBVd RV3383 10-7 78.59 Ii 목크 (목)는 RV4 10-3 78.81 Iii IKOV RV2508 10-5 79.67 Iii LLEBV RV3208 10-4 79.15 Iii WCBV RV3384 10-3 79세 표 6: 3개의 필로군에 걸쳐 대표적인 리사바이러스에 대한 범리사바이러스 실시간 RT-PCR 특이성, 민감도 및 Tm의 요약. 리사바이러스에 걸친 평균 Tm은 78.81(SD 0.531)이었다.