JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Isolierung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb zur Untersuchung des bakteriellen Pathogens Fettsäure-Inkorporation in Membranphospholipide

Published: May 15, 2019
doi:
10.3791/59538
, ,
1Department of Microbiology and Molecular Genetics,Michigan State University, 2Department of Physiology,Michigan State University

Summary

Diese Methode bietet einen Rahmen für die Untersuchung der Einbeziehung von exogenen Fettsäuren aus komplexen Wirtsquellen in bakterielle Membranen, insbesondere Staphylococcus aureus. Um dies zu erreichen, werden Protokolle zur Anreicherung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb und anschließende Fettsäureprofilierung von bakteriellen Phospholipiden unter Verwendung der Massenspektrometrie beschrieben.

Abstract

Staphylococcus aureus und andere grampositive Erreger integrieren Fettsäuren aus der Umwelt in Membranphospholipide. Während der Infektion sind die meisten exogenen Fettsäuren in Wirtslipoproteinpartikeln vorhanden. Ungewissheit bleibt hinsichtlich der Reservoirs von Wirtsfettsäuren und der Mechanismen, durch die Bakterien Fettsäuren aus den Lipoproteinpartikeln extrahieren. In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle zur Anreicherung von Lipoproteinpartikeln mit geringer Dichte (LDL) aus Hühnereigelb und bestimmen, ob LDLs als Fettsäurereservoirs für S. aureusdienen. Diese Methode nutzt unvoreingenommene lipidomische Analysen und Hähnchen-LDLs, ein effektives und wirtschaftliches Modell für die Erforschung von Wechselwirkungen zwischen LDLs und Bakterien. Die Analyse der Integration von exogenen Fettsäuren aus LDLs wird mit hoher Auflösung/genauer Massenspektrometrie und Tandemmassenspektrometrie durchgeführt, die die Charakterisierung der Fettsäurezusammensetzung der bakteriellen Membran und unvoreingenommene Identifizierung neuartiger Kombinationen von Fettsäuren, die bei Exposition gegenüber LDLs in bakteriellen Membranlipiden entstehen. Diese fortschrittlichen Massenspektrometrietechniken bieten eine unvergleichliche Perspektive der Aufnahme von Fettsäure, indem sie die spezifischen exogenen Fettsäuren, die in die Phospholipide eingearbeitet sind, offenlegen. Die hier beschriebenen Methoden sind an die Untersuchung anderer bakterieller Krankheitserreger und alternativer Quellen komplexer Fettsäuren anpassungsfähig.

Introduction

Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) ist die Hauptursache für gesundheitsbezogene Infektionen und die damit verbundene Antibiotikaresistenz ist eine erhebliche klinische Herausforderung1,2,3. Daher hat die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien einen hohen Stellenwert. Eine vielversprechende Behandlungsstrategie für Gram-positive Krankheitserreger ist die Hemmung der Fettsäuresynthese, eine Anforderung für die Membranphospholipid-Produktion, die in S. aureusPhosphatidylglycerol (PG), Lysyl-PG und Cardiolipin4umfasst. Bei Bakterien erfolgt die Fettsäureproduktion über den Fettsäuresynthese-II-Signalweg (FASII) 5 ,dersich erheblich vom eukaryotischen Pendant unterscheidet, was FASII zu einem attraktiven Ziel für die Antibiotikaentwicklung macht5,6 . FASII-Inhibitoren zielen in erster Linie auf FabI ab, ein Enzym, das für die Ausdehnung der Fettsäure-Kohlenstoff-Kettendehnung7benötigt wird. Der FabI-Hemmer Triclosan wird in Konsumgütern und medizinischen Produkten weit verbreitet8,9. Weitere FabI-Inhibitoren werden von mehreren Pharmaunternehmen zur Behandlung der S. aureus-Infektionentwickelt 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Jedoch, viele Gram-positive Krankheitserreger, einschließlich S. aureus, sind in der Lage, exogene Fettsäuren für die Phospholipid-Synthese zu fangen, unter Umgehung FASII Hemmung27,28,29. So wird das klinische Potenzial von FASII-Hemmern diskutiert, da wir über die Quellen von Wirtsfettsäuren und die Mechanismen, mit denen Krankheitserreger Fettsäuren aus dem Wirt extrahieren, erhebliche Lücken haben27,28. Um diese Lücken zu schließen, entwickelten wir eine unvoreingenommene lipidomische Analysemethode, um die Einbindung exogener Fettsäure aus Lipoproteinpartikeln in Membranphospholipide von S. aureuszu überwachen.

Während der Sepsis stellen Wirtslipoproteinpartikel eine potenzielle Quelle von wirtabgeleiteten Fettsäuren innerhalb der Vaskulatur dar, da ein Großteil der Wirtsfettsäuren mit den Partikeln30assoziiert ist. Lipoproteine bestehen aus einer hydrophilen Schale, die aus Phospholipiden und Proteinen besteht, die einen hydrophoben Kern von Triglyceriden und Cholesterinestern umschließen31. Vier Hauptklassen von Lipoproteinen – Chylomicron, Lipoprotein mit sehr geringer Dichte, Lipoprotein mit hoher Dichte und Lipoprotein mit geringer Dichte (LDL) – werden vom Wirt hergestellt und fungieren als Lipidtransportfahrzeuge, die Fettsäuren und Cholesterin von und zu Wirtszellen über die Vaskulatur. LDLs sind reichlich in veresterter Fettsäure einschließlich Triglyceriden und Cholesterinester31. Wir haben bereits gezeigt, dass hochgereinigte menschliche LDLs eine lebensfähige Quelle von exogenen Fettsäuren für die PG-Synthese sind und somit einen Mechanismus für den FASII-Inhibitorbypass32bieten. Die Reinigung menschlicher LDLs kann technisch anspruchsvoll und zeitaufwändig sein, während kommerzielle Quellen gereinigter menschlicher LDLs unerschwinglich teuer sind, um sie routinemäßig zu verwenden oder großangelegte bakterielle Bildschirme durchzuführen. Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir ein Verfahren zur Anreicherung von LDLs aus Hühnereigelb, einer reichen Quelle von Lipoproteinpartikeln33, modifiziert. Wir haben erfolgreich ungezielte, hochauflösende/genaue Massenspektrometrie und Tandem-Massenspektrometrie eingesetzt, um die Einbindung menschlicher LDL-Fettsäuren in die Membran von S. aureus32zu überwachen. Im Gegensatz zu zuvor berichteten Methoden kann dieser Ansatz einzelne Fettsäure-Isomere für jeden der drei wichtigsten Staphylokokken-Phospholipid-Typen quantifizieren. Ölsäure (18:1) ist eine ungesättigte Fettsäure in allen Wirts-Lipoproteinpartikeln, die leicht in S. aureus phospholipide29,30,32eingearbeitet werden kann. S. aureus ist nicht in der Lage, Ölsäure-Synthese29; Daher stellt die Menge der phospholipidhaltigen Ölsäure das Vorhandensein von wirtlipoproteinabgeleiteten Fettsäuren in der Staphylokokkenmembran29fest. Diese Phospholipid-Arten können durch die hier beschriebene hochmoderne Massenspektrometriemethode identifiziert werden, die eine beispiellose Auflösung der Membranzusammensetzung von S. aureus bietet, die in Gegenwart einer Fettsäurequelle kultiviert wird, die wahrscheinlich Begegnungen während der Infektion.

Protocol

HINWEIS: Das folgende Protokoll zur Anreicherung von LDL-Partikeln aus Hühnereigelb stammt von Moussa et al. 200233. 1. Herstellung von Hühnereigelb zur Anreicherung von LDL-Partikeln Zwei große Hühnereier durch Waschen der Schalen mit 70% Ethanollösung sanieren und lufttrocknen lassen. Den Eiabscheider mit 70% Ethanollösung desinsieren und lufttrocknen lassen. Befestigen Sie den Eiabscheider an der Lippe eines mittelgroßen Bechers. …

Representative Results

Das Protokoll zur Anreicherung von LDL aus Hühnereigelb ist in Abbildung 1dargestellt. Dieser Prozess beginnt mit der Verdünnung von ganzem Eigelb mit Kochchen und der Trennung der Eigelbfeststoffe, die als Granulat bezeichnet werden, von der löslichen oder Plasmafraktion, die die LDLs enthält (Abbildung 1)33. Der LDL-Gehalt der Plasmafraktion wird durch die Ausfällung der 30-40 kDa-Livetine (Abbildun…

Discussion

S. aureus integriert exogene Fettsäuren in seine Membranphospholipide27,32,43. Die Phospholipidsynthese mit exogenen Fettsäuren umgeht die FASII-Hemmung, verändert aber auch die biophysikalischen Eigenschaften der Membran27,32,44. Während die Aufnahme von exogenen Fettsäuren in Phospholipide grampositiver Erreger gut dokum…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Mitgliedern des Hammer Labors für die kritische Bewertung des Manuskripts und die Unterstützung dieser Arbeit. Dr. Alex Horswill von der University of Colorado School of Medicine stellte freundlicherweise AH1263 zur Verfügung. Dr. Chris Waters Labor an der Michigan State University lieferte Reagenzien. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der American Heart Association 16SDG30170026 und Start-up-Fonds der Michigan State University unterstützt.

Materials

Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts – Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Tags

Lipoprotein ParticlesChicken Egg YolkBacterial PathogenFatty Acid IncorporationMembrane PhospholipidsLipidomic AnalysisStaphylococcus AureusAmmonium SulfateDialysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image